Похожие статьи

коз и газировка:

Каждую неделю мы отвечаем на «часто задаваемые вопросы» о жизни во время кризиса с коронавирусом. И мы просим читателей присылать свои запросы. Некоторые из вопросов, которые мы получаем, немного … необычны. Возможно, это не самые важные вопросы для здоровья. Тем не менее, они определенно интересны. Итак, на этой неделе вот несколько часто задаваемых и редко задаваемых вопросов. Если у вас есть вопрос, который вы хотели бы, чтобы мы рассмотрели в будущем, напишите нам по адресу goatsandsoda @ npr.org с темой: «Еженедельные вопросы о коронавирусе».

Безопасно ли для ремонтника работать в моем доме?

Когда дело доходит до возвращения домой ремонтника, важно взвесить необходимость ремонта с потенциальным риском передачи.

«Все зависит от того, насколько срочно, по их мнению, требуется ремонт», — говорит д-р Марк Кортепетер, профессор эпидемиологии Колледжа общественного здравоохранения Медицинского центра Университета Небраски.

«Все, что мы делаем, должно быть связано с расчетом риска и прибыли, и я бы не стал останавливать необходимый ремонт, если он действительно нужен — точно так же, как я бы не перестал ходить в продуктовый магазин».

Некоторый ремонт может быть действительно необходим для комфорта и безопасности вашей домашней жизни, говорит Кортепетер, и если это так, он говорит, что есть вещи, которые вы можете сделать, чтобы снизить риск распространения вируса, насколько это возможно.

Чтобы ограничить обмен частицами с обслуживающим работником, попросите его сделать обычные вещи: надеть маску, снять обувь и использовать дезинфицирующее средство для рук, прежде чем они начнут работать.По его словам, для вашей и своей защиты каждый член вашей семьи должен носить маску на время работы в вашем доме.

Пока они работают, рекомендуется не входить в комнату, пока они не закончат работу, и продезинфицировать область в дополнение к дверным ручкам или поверхностям, к которым ремонтник мог прикоснуться во время своего визита. Если они попросят вас воспользоваться вашей ванной, может быть неловко сказать «нет», поэтому Кортепетер советует просто постараться не входить сразу после того, как они смываются.

В целях особой осторожности врач Гарвардской медицинской школы доктор Абраар Каран также рекомендует заранее позвонить в ремонтную компанию, чтобы узнать, проверяет ли она рабочих на наличие симптомов COVID и потенциального заражения вирусом.

Вам также следует подумать о том, кто находится дома, — говорит Каран. Если есть член семьи из группы высокого риска и с ослабленным иммунитетом, подумайте о том, чтобы отложить ремонт или как можно дольше избегать контактов этого человека с техником, оставив его в другой комнате.

Новое исследование показывает, что смыв унитаза может выпустить в воздух затяжные облака частиц коронавируса, обнаруженных в фекалиях.Какую опасность представляют эти «туалетные шлейфы» для заражения?

Сейчас ученые не совсем уверены, насколько велик риск покраснения, когда дело доходит до заражения COVID-19, объясняет Кортепетер. Но есть еще некоторые меры гигиены в ванной, которые вы должны предпринять в ближайшее время, чтобы свести к минимуму потенциальную возможность передачи инфекции.

Хотя частицы вирусного коронавируса были обнаружены в фекалиях, Центры по контролю и профилактике заболеваний заявляют, что «неясно, может ли вирус, обнаруженный в фекалиях, вызывать COVID-19».«И, несмотря на то, что [ученые] обнаружили в образцах воздуха над туалетами остающуюся РНК SARS-CoV-2, [они] не выращивали вирус из этих образцов в культуре, чтобы увидеть, можно ли выделить жизнеспособный вирус», — объясняет Каран в электронном письме. в NPR. «[И это] важный вопрос о риске передачи».

Хотя это не было задокументировано, Кортепетер говорит, что он мог представить несколько способов, которыми туалетные шлейфы потенциально могут привести к инфекции. после смыва, который может вдохнуть кто-то из более поздних пользователей туалета.Или, как он предполагает, более тяжелые капли могут «осесть» на поверхностях — скажем, на сиденье унитаза, на полу или в металлических канистрах с туалетной бумагой. Эти частицы впоследствии могут быть захвачены прикосновением и перенесены на чувствительные части лица (глаза, нос, рот), вызывая инфекцию.

Но это лишь предположения, — говорит Кортепетер. И до сих пор неясно, как выглядит риск передачи от туалета человеку — и насколько он значительный.

Тем временем врачи предлагают принять меры предосторожности в ближайшем будущем, чтобы свести к минимуму вероятность распространения вируса из смывных шлейфов, особенно если вы пользуетесь общественным туалетом или чужой ванной.Один совет от Kortepeter — закрыть крышку унитаза перед смывом, чтобы ограничить количество фекальных частиц, попадающих в воздух под давлением смыва. Он также рекомендует носить маску, чтобы свести к минимуму вдыхание капель, и мыть руки водой с мылом после посещения туалета, чтобы убить любые вирусные частицы, которые вы могли подобрать.

И, добавляет он, «минимизируйте время, которое вы проводите в туалете», — говорит Кортепетер. «Выберите киоск, который не только что освободили до вас, или подождите минутку.»

Наконец, если вы живете с кем-то, кто инфицирован, и у вас в доме несколько ванных комнат, Кортепетер предлагает ограничить их одним туалетом, чтобы свести к минимуму риск передачи инфекции. Для тех, у кого только одна ванная комната, это хорошо. Идея следовать приведенным выше рекомендациям относительно ношения маски, мытья рук и закрытия крышки при промывании, чтобы избежать потенциальной передачи шлейфа.

Можно ли снова пойти в салон для получения таких услуг, как маникюр, педикюр или массаж?

Исследователи говорят, что когда дело доходит до салонных услуг, следует учитывать несколько моментов.Но самый большой вопрос, который нужно задать себе, продвигаясь вперед с определенной процедурой: действительно ли она вам нужна?

«Любой контакт лицом к лицу, особенно продолжительный, должен осуществляться в маске, в идеале обеими сторонами», — говорит Каран. «Опять же, маски не идеальны, поэтому я бы, вероятно, избегал часового массажа прямо сейчас, поскольку это довольно продолжительный близкий контакт в одной комнате — и массажистка, вероятно, поддерживает тесный контакт со многими другими людьми в течение дня».

Если вы собираетесь сделать маникюр / педикюр, Кортепетер советует вам пойти в салон в то время дня, когда там меньше людей.Или подумайте о том, чтобы проводить только одну процедуру за раз, чтобы минимизировать время, в течение которого вы общаетесь с другими.

На вопрос, являются ли некоторые услуги салона более рискованными, чем другие, Кортепетер ответил, что опасность возрастает в зависимости от времени контакта и количества людей в учреждении. По его словам, в конечном итоге это риски, которые вы должны взвесить для себя.

Обрызгать себя дезинфицирующим средством — это хорошая идея?

Ответ здесь — однозначно — нет. Фактически, U.Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США предупредило об этом на этой неделе.

«Дезинфицирующее средство предназначено для поверхностей, а не для кожи», — говорит Кортепетер. «Основное место, которое необходимо мыть после того, как вы вышли на улицу, — это руки, и вы можете сделать это, просто вымыв их. Чего вы не хотите делать, так это наносить потенциально токсичные вещества на кожу — это может вызвать ожоги кожи. и травмы «.

Опрыскивание себя дезинфицирующим средством не снизит риск заражения, говорит Кортепетер. Но при этом есть риск нанести вред вашей коже и глазам.

«Я бы сказал, используйте эти деньги, чтобы купить маску», — говорит Каран. «И носить его».

Как быть в безопасности, когда вашему дому требуется ремонт во время пандемии коронавируса

Что еще вы можете сделать: Откройте двери и окна. Свежий воздух может растворить любой вирус, который, возможно, попал в поездку с сервисной техникой. Также может помочь центральный кондиционер.

Имейте в виду, что работники тоже беспокоятся о своей безопасности. Соблюдая дистанцию ​​и спрашивая о мерах предосторожности, вы поможете им расслабиться.Наденьте маску, прежде чем открывать дверь, а затем не снимайте ее, пока вы оба находитесь дома. Поместите дезинфицирующее средство для рук возле входа в дом или в рабочей зоне. Если вы уезжаете — или остаетесь в другой части дома — дайте обслуживающему персоналу номер вашего мобильного телефона, чтобы ему или ей не пришлось вас выслеживать.

Ремонтные мастерские пытаются приспособиться к новым условиям

Пандемия коронавируса создала огромные проблемы для специалистов по ремонту, которым необходимо находиться в домах, чтобы выполнять свою работу.Они знают, что многие клиенты обеспокоены. Checkbook связалась с несколькими ведущими сервисными компаниями, чтобы узнать, как они реагируют на новую реальность.

«Это своего рода стресс для наших парней, потому что некоторые люди напуганы», — сказал Адам Белл, совладелец Durance Plumbing в Такома-Парке, штат Мэриленд. «У нас есть пожилые клиенты или те, у кого новорожденные, которые отказались от услуг в последний раз. минут или по мере нашего появления, что делает график немного сумасшедшим ».

Большинство сервисных компаний стремятся вернуться к своей работе, но некоторые делают это медленно, путешествуя по неизведанным водам.ALCO Appliance, компания по ремонту бытовой техники в Белтсвилле, штат Мэриленд, разместила это уведомление на своем веб-сайте:

«Пожалуйста, не записывайтесь на прием, если в этом нет необходимости. Мы знаем, что вы вернулись с работы и сейчас, кажется, прекрасное время, чтобы починить сломанный льдогенератор, заменить лампочку или отремонтировать сломанные часы на плите. Это не стоит ненужных контактов с нами или вами. Мы только записываемся на НЕОБХОДИМЫЙ ремонт. Необходимый ремонт — это когда прибор больше не выполняет свою ОСНОВНУЮ функцию или что-то вышло из строя, что вызывает или может вызвать материальный ущерб.”

Компании также меняют методы своей работы. Наиболее частые изменения представители компании, упомянутые в чековой книжке:

• Сотрудники обеспечиваются средствами индивидуальной защиты, такими как маски, респираторы и перчатки.
• Введены новые процедуры дезинфекции оборудования до и после каждого посещения на дому.
• Любые поверхности, к которым прикасаются внутри дома, дезинфицируются.
• Сотрудников научили дистанцироваться от общества и уважать заботу клиентов о безопасности.
• Компании планируют более длительные обращения в службу поддержки, поэтому обслуживающий персонал может немного сбавить обороты и сосредоточиться на безопасности, а также на выполняемой работе.
• Многие предприятия не принимают наличные. Большинство по-прежнему принимает чеки. Но многие другие теперь могут обрабатывать платежи по кредитным картам на месте или по телефону.

Будьте информированным клиентом

Многие сервисные компании предоставляют инструкции по технике безопасности перед визитами, чтобы защитить своих клиентов и сотрудников. Будьте готовы потратить больше времени на телефон, когда звоните, чтобы назначить встречу.

В случае неисправного устройства будьте готовы сообщить марку и номер модели, а также указать, в чем проблема. Узнав больше о проблеме заранее, сервисный техник с большей вероятностью найдет в грузовике подходящие запасные части, которые могут предотвратить обратную поездку.

Может быть, стоит подождать.

Некоторые проблемы — протекающая труба, неработающая стиральная машина — требуют незамедлительного внимания. То же самое касается всего, что связано с безопасностью, например запаха дыма от выключателя света.Проекты, которые предполагают работы вне дома, такие как новый настил, ремонт крыши или ландшафтный дизайн, можно выполнять безопасно.

Но не пора ли отремонтировать кухню или ванную комнату? У каждого своя толерантность к риску, но многие эксперты в области здравоохранения рекомендуют этого не делать. Если во время пандемии вам необходимо завершить долгосрочный проект, подумайте о проживании в отеле или краткосрочной аренде на этот срок.

С осторожностью относитесь к заявлениям о вреде для здоровья

Во время пандемии компании, занимающиеся чисткой ковров и воздуховодов, размещают объявления о пользе для здоровья, которую они предоставляют.Некоторые компании HVAC заявляют, что воздушные УФ-фильтры убивают вирусы. По большей части это просто маркетинговая шумиха.

Хотя чистка вашего ковра и ковриков удалит запахи, пыль и микробы, нет никаких доказательств того, что это обеспечивает какую-либо защиту от нового коронавируса.

Точно так же скептически относитесь к заявлениям компаний, занимающихся HVAC, о том, что они могут установить УФ-фильтры, которые устранят микробы. Пока никто не знает, излучают ли устройства, доступные для домашнего использования, достаточно УФ-дозы, чтобы эффективно убить коронавирус.

Вашингтонский журнал потребительских чеков и Checkbook.org — это некоммерческая организация, цель которой — помочь потребителям получить лучшее обслуживание по самым низким ценам. Он поддерживается потребителями и не требует денег от поставщиков услуг, которых он оценивает. Вы можете получить доступ ко всем рейтингам и советам Checkbook до 25 августа по адресу Checkbook.org/WashingtonPost/repairs .

Ремонт iPhone — Официальная служба поддержки Apple

Оригинальные запчасти

Оригинальные запчасти Apple крайне важны для качественного ремонта.Посетите Apple Store или авторизованного поставщика услуг Apple, чтобы убедиться, что ваш продукт снова работает должным образом.

Ремонт экрана

Вы можете отремонтировать треснувший экран iPhone в Apple Store, у авторизованного поставщика услуг Apple или отправив его в сервисный центр Apple. Если у вас есть план AppleCare +, вы можете использовать его для покрытия ремонта экрана.

Во всех этих местах используются оригинальные запчасти Apple, чтобы ваш экран после ремонта работал как новый.В некоторых местах обслуживание осуществляется в тот же день.

Записаться на прием или запросить обслуживание
См. Расценки на ремонт экрана

Замена батареи

Если у вашего аккумулятора возникла проблема, на которую распространяется Ограниченная гарантия Apple, AppleCare + или закон о защите прав потребителей, мы бесплатно обслужим ваш iPhone.

Наша гарантия не распространяется на аккумуляторы, которые изнашиваются в результате нормального использования. Если аккумулятор изнашивается, мы предлагаем послегарантийное обслуживание аккумулятора за определенную плату.

Если у вас есть AppleCare +, она покрывает ваш iPhone без дополнительной подзарядки, если аккумулятор вашего продукта занимает менее 80 процентов от первоначальной емкости. Возможно, нам потребуется протестировать ваш продукт, чтобы найти причину проблемы с аккумулятором.

Записаться на прием или запросить обслуживание
См. Расценки на замену батареи

Другой ремонт iPhone

Нужен ли вам ремонт в связи с другими проблемами, такими как кнопка «Домой» или повреждение жидкости?

• Если проблема с вашим iPhone покрывается гарантией Apple, AppleCare + или законодательством о защите прав потребителей, плата не взимается.Сюда не входит случайное повреждение, за которое взимается плата.
• Если ваш iPhone был поврежден и у вас есть AppleCare +, покрытие включает защиту от случайного повреждения. За каждый инцидент взимается плата за обслуживание.
• Если ваш iPhone был поврежден и у вас нет AppleCare +, плата за ремонт будет варьироваться в зависимости от ремонта, вплоть до суммы послегарантийной платы, указанной ниже. Эти послегарантийные цены относятся к ремонту, произведенному Apple. Авторизованные поставщики услуг Apple могут устанавливать свои собственные сборы.

Не уверен, что вы застрахованы? Проверьте, есть ли у вас покрытие AppleCare +, введя серийный номер iPhone.

Подробнее об AppleCare + для iPhone

Прочие расходы на ремонт iPhone в США

Внегарантийные цены распространяются только на ремонт, произведенный Apple. Авторизованные поставщики услуг Apple могут устанавливать свои собственные цены.

Все комиссии указаны в долларах США и облагаются налогом.Если нам потребуется отправить ваш iPhone, будет добавлена ​​плата за доставку в размере 6,95 долларов США.

Кража и потеря

Если ваш iPhone был утерян или украден и у вас есть AppleCare + с услугой Theft and Loss, вы можете подать иск о замене пропавшего iPhone.

Узнайте больше об AppleCare + с функцией Theft and Loss

Аксессуары для Apple

На аксессуары марки Apple, включая адаптер питания, распространяется наша гарантия и закон о защите прав потребителей.На аксессуары AppleCare +, входящие в комплект поставки, также распространяется действие вашего плана AppleCare +. За подробностями обращайтесь к своему оператору, Apple или авторизованному поставщику услуг Apple.

Ознакомьтесь с ограниченной гарантией Apple на аксессуары
Обратитесь в службу поддержки Apple

Повреждение ДНК, индуцированное во время митоза, подвергается репарационному синтезу ДНК

Abstract

Понимание реакции митотического повреждения ДНК (DDR) имеет решающее значение для нашего понимания рака, преждевременного старения и нарушений развития, которые характеризуются дефицитом репарации ДНК.В этом исследовании мы используем микро-сфокусированный лазер, чтобы вызвать повреждение ДНК в выбранных митотических хромосомах, чтобы изучить последующую реакцию репарации. Наши результаты показывают, что (1) митотические клетки способны к репарации ДНК, о чем свидетельствует синтез ДНК в местах повреждения, (2) восстановление ослабляется, когда ДНК-PKcs и ATM одновременно нарушаются, (3) лазерное повреждение может позволить наблюдать ранее необнаруженные белки DDR, когда повреждение вызывается другими методами в митозе, и (4) двадцать пять процентов митотических ДНК-поврежденных клеток подвергаются последующему митозу.Вместе эти данные предполагают, что митотический DDR более сложен, чем считалось ранее, и может включать факторы из нескольких путей восстановления, которые лучше понимаются в интерфазе.

Образец цитирования: Gomez Godinez V, Kabbara S, Sherman A, Wu T, Cohen S, Kong X, et al. (2020) Повреждение ДНК, вызванное во время митоза, подвергается репарационному синтезу ДНК. PLoS ONE 15 (4): e0227849. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849

Редактор: Артур Дж.Lustig, Центр медицинских наук Тулейнского университета, США

Поступила: 27 декабря 2019 г .; Принят в печать: 1 апреля 2020 г .; Опубликовано: 28 апреля 2020 г.

Авторские права: © 2020 Gomez Godinez et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: файлов необработанных изображений доступны в цифровых коллекциях библиотеки Калифорнийского университета в Сан-Диего https://doi.org/10.6075/J08W3BQK.

Финансирование: Эта работа частично поддержана грантом AFOSR № FA9550-08-1-0384 (MWB), программой обучения международным исследованиям в области здоровья меньшинств и неравенства в отношении здоровья (MHIRT) Грант NIH MD-01485 (VGG), Национальная наука. Foundation MCB-1615701 (KY) и подарком от Beckman Laser Institute Foundation (MWB).Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Сокращения: DSB, двухрядный разрыв; ГДР, Ответ на повреждение ДНК; HR, Гомологичный рекомбинационный ремонт; NHEJ, Негомологичное соединение концов; NER, Эксцизионное восстановление нуклеотидов; EdU, 5-этинил-2´-дезоксиуридин; ДНК PKcsi ДНК ингибитор PKcs; ATMi, Ингибитор АТМ; ПАРПИ, Ингибитор PARP

Введение

Повреждение ДНК происходит естественным образом в результате различных эндогенных и экзогенных процессов.Необработанная ДНК может нарушить генетическую целостность, что приведет к нарушениям развития, гибели клеток или раку. У организмов появилось множество способов реагировать на повреждения. Подавляющее большинство исследований реакций на повреждение ДНК проводилось во время интерфазы клеточного цикла. Однако понимание реакции на повреждение ДНК (DDR) во время митоза также важно, поскольку мутации, накопленные во время митоза, могут приводить к хромосомным аберрациям, геномной нестабильности дочерних клеток, старению и, в конечном итоге, гибели клеток [1–4].

Исследования, изучающие степень активации и репарации DDR в митозе, в первую очередь оценивали клеточный ответ на двухцепочечные разрывы (DSB). DSB могут быть восстановлены путем гомологичной рекомбинации (HR) и негомологичного соединения концов (NHEJ). HR сохраняет генетическую достоверность, поскольку он полагается на гомологичный шаблон для восстановления поврежденной ДНК. С другой стороны, NHEJ приводит к лигированию разорванных концов, что может привести к потере генетической информации. Исследования, изучающие DDR DSBs в митозе, обнаружили укороченную DDR, которая не ведет к накоплению ubiquitin ligases, а также 53BP1 и BRCA1 в сайтах митотических повреждений [2, 5-10].Последующие исследования показали, что митоз-специфическое фосфорилирование 53BP1 с помощью polo-like kinase 1 (PLK1) блокирует связывание 53BP1 с хроматином [11, 12]. Более того, было обнаружено, что RAD51 и образование филаментов ингибируются с помощью CDK1 в митозе [13, 14]. Взятые вместе, восстановление DSB, как NHEJ, так и HR, как полагали, ингибируется в митозе.

Далее, синтез ДНК был исследован на ранних этапах митоза в отношении повреждения ДНК в результате стресса репликации. Однако было показано, что эта форма репарации зависит от процесса, который активируется только в очень поздней G2 / ранней профазе [15-22].Клетки, обработанные афидиколином в S-фазе, имели Rad52 и MUS81-EME1-зависимый синтез ДНК на уязвимых участках хромосом во время очень ранней профазы [16, 17]. Комплекс MUS81-EME1 и геликаза BLM необходимы для перезапуска синтеза ДНК после стресса репликации [18–20]. Интересно, что клетки, синхронизированные с прометафазой, не подвергались репликационному стрессу, индуцированному синтезом репарации ДНК [16, 17]. Кроме того, MUS81 связан с уязвимыми участками хромосом в профазе, но с меньшей скоростью в метафазе [18].Эта форма синтеза ДНК получила название MiDAS (митотический репарационный синтез ДНК), и ее не следует путать с репарационным синтезом ДНК, описанным в этой статье. Механизм синтеза ДНК, индуцированный стрессом репликации, вероятно, отличается от механизма, наблюдаемого в ответ на повреждение, вызванное другими способами, и от повреждений, индуцированных в других фазах, таких как прометафаза, метафаза и анафаза. Таким образом, способность митотических клеток подвергаться репарационному синтезу ДНК в ответ на повреждения, вызванные во время митоза, еще предстоит выяснить.

В большинстве исследований DDR использовалось ионизирующее излучение или радиомиметические препараты, чтобы вызвать повреждение ДНК и изучить последующие механизмы репарации ДНК. Эти методы индукции повреждения ДНК приводят к изменениям во всем геноме, которые могут привести к различным DDR. Тем не менее, лазер оказался очень полезным для исследований реакции на повреждение ДНК из-за его способности воздействовать на субмикронную область внутри указанной области хромосомы [23–29]. Интересно, что исследование с использованием лазерного микрооблучения, проведенное более сорока лет назад, показало, что, когда ядрышковый организатор был специфически поврежден в митотических клетках, некоторые из облученных клеток смогли подвергнуться последующему митозу.Анализ кариотипа выявил интактные хромосомы с дефицитом ядрышкового организатора [26, 30]. В сегодняшнем контексте эти результаты предполагают, что клетки, скорее всего, восстанавливали повреждения митотической ДНК посредством NHEJ.

Исследования нашей и других лабораторий показали способность сфокусированного лазерного микропучка ближнего инфракрасного диапазона (NIR) с длиной волны 780 нм с ограничением дифракции индуцировать DSB, отмеченные γh3AX, фосфорилированным гистоном h3AX на Ser 139 и KU как в интерфазе, так и в митозе [ 29, 31–37]. В дополнение к γh3AX и KU на участках, поврежденных лазером, мы продемонстрировали, что убиквитилирование также происходит на участках повреждения при митозе [28, 29].Хотя наши результаты отличаются от результатов с использованием ионизирующего излучения [5, 10], подход лазерного микрооблучения позволяет визуализировать такие белки, как KU, которые не образуют индуцированных ионизирующим излучением фокусов (IRIF) [38]. Следовательно, неудивительно видеть накопление белков DDR в поврежденных лазером областях митоза, которые ранее считались исключенными из повреждения митотической ДНК.

В настоящем исследовании мы систематически охарактеризовали природу митотического повреждения ДНК, вызванного NIR-лазером, и провели количественный анализ репарации ДНК в митозе и последующей фазе G1 в клетках кенгуру человека и крысы ( Potorous tridactylus ).В наших условиях микрооблучение митотических хромосом с помощью NIR-лазера вызывает комплексное повреждение, состоящее как из двухцепочечных разрывов (DSB), так и из однонитевых разрывов (SSB), а также повреждений, связанных с перекрестными связями в ультрафиолетовом (УФ) диапазоне (димеры пиримидина), аналогичные тому, что было недавно. описан для повреждения интерфазных клеток [39]. Мы демонстрируем, что факторы из различных путей репарации, функция которых лучше понимается в интерфазе, способны реагировать на повреждение митотической ДНК. Наши результаты также показывают, что DSB, генерируемые на метафазных хромосомах, приводят к кластеризации различных белков, участвующих в NHEJ и HR.Мы показываем, что репарация ДНК митотических повреждений ДНК продолжается и сохраняется в G1.

Материалы и методы

Реактивы

Список антител см. В приложении S3. Другие реагенты перечислены в соответствующих методах ниже.

Клеточные линии

В этом исследовании использовали пять линий клеток человека. Клетки U-2 OS, обозначаемые в этой статье как U2OS, представляют собой линию клеток остеосаркомы ATCC HTB 96, которая использовалась в большинстве исследований, если не указано иное.Также использовали CFPAC-1 ATCC CRL 1918, линию, полученную из аденокарциномы поджелудочной железы с кистозным фиброзом. Изогенные клеточные линии M059K ATCC 2365 и M059J ATCC 2366 использовали для сравнения ответа митотической ДНК при отсутствии ДНК-PKcs (M059J). M059K содержит форму ДНК-PKcs дикого типа, что делает эту линию хорошим контролем для мутанта DNA-PKcs. Обе клеточные линии происходят из глиобластомы у одного и того же пациента. Клетки кенгуру крысы (PtK2) из ​​Potorous tridactylus были использованы из-за их больших хромосом и сильной адгезии к субстрату, что облегчает митотические исследования.Эти клетки выращивали в Advanced DMEM / F12 с 1% глутамакса и 10% фетальной бычьей сыворотки. Все человеческие клетки выращивали в Advanced DMEM с добавлением 1% глутамакса и 10% фетальной бычьей сыворотки. Все клетки поддерживали в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ . Клетки высевали на чашки со стеклянным дном от MatTek до степени слияния 40% и использовали через 1-2 дня после пересева. Эксперименты проводились в среде, содержащей 40 нокодазол / мл. Для экспериментов по ингибированию использовали следующие концентрации: ингибитор ATM (10 мкМ KU55933), ингибитор PKcs ДНК (3 мкМ NU7441) и ингибитор PARP (100 мкМ Nu1025).

Лазерное повреждение ДНК и получение изображения под микроскопом

Митотические хромосомы в живых клетках облучали с использованием дифракционно ограниченных (диаметром 0,5–1 мкм) фокальных пятен с помощью фемтосекундного микроимпульсного лазера Coherent Mira 76 МГц с частотой 200 нм, излучающего на длине волны 780 нм (Coherent Inc., Санта-Клара, Калифорния). Серия расширителей луча и зеркал вводила луч в правый порт инвертированного микроскопа Zeiss Axiovert 200M. Зеркало с быстрым сканированием X-Y было расположено на пути луча перед входом в порт микроскопа, чтобы облегчить перемещение сфокусированного лазерного луча к желаемой цели.Луч фокусировался через масляный объектив Zeiss Plan-Apochromat 63x (1,4 NA). Энергия излучения лазера контролировалась с помощью поляризатора Глана-Томпсона, установленного на моторизованном вращающемся столике. Механический затвор Uniblitz контролировал время экспозиции лазера. Единственная хромосома в клетке была нацелена лазером, если не указано иное. Хромосомы подвергались воздействию лазера в течение 10 мс в пределах фокального пятна. Эта экспозиция привела к появлению 7,6х10 ⁵ импульсов света на пятно размером 0.Диаметр 68 мкм при выбранной энергетической освещенности 2,8–3,2×10 ¹¹ Вт / см ² .

изображений было собрано с помощью Hamamatsu CCD Orca [33, 40, 41]. Поляризатор, сканирующее зеркало и затвор управлялись с помощью программного обеспечения, разработанного с помощью LabView [42]. Для определения освещенности в фокусной точке пропускание объектива измерялось с использованием модифицированного метода двойного объектива, описанного ранее [28]. Объектив, использованный в этих экспериментах, имел пропускание 0,50 на длине волны лазера.Основываясь на измеренной энергетической освещенности 2,8–3,2×10 ¹¹ Вт / см ² , механизм повреждения, вероятно, имеет многофотонную природу, либо 2-фотонную, либо 3-фотонную, либо их комбинацию.

Иммуноокрашивание

Клетки фиксировали 4% параформальдегидом в фосфатно-солевом буфере в течение 20 минут. Время фиксации после лазерного воздействия варьировалось в зависимости от эксперимента. Клетки пермеабилизировали в течение ночи с помощью блокирующего буфера, содержащего 0,1% TritonX и 5% фетальной бычьей сыворотки в фосфатно-солевом буфере, с последующим окрашиванием первичными антителами.В приложении S3 показан список использованных антител. Для большинства первичных антител применяли разведение 1: 500. Вторичными антителами против первичных антител были козьи антимышиные антитела Alexa-488 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) и козьи антитела против кроликов Cy3 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) в разведениях 1: 2000.

Обнаружение синтеза ДНК

Для тестирования репарации / синтеза ДНК клетки инкубировали с 10 мкл M EdU (5-этинил-2’-дезоксиуридин) за 1-20 минут до воздействия лазера. Исходный раствор EdU с концентрацией 10 мМ готовили согласно протоколу (каталог Invitrogen № C10339).Клетки, требующие длительного митоза, одновременно инкубировали с колцемидом и EdU за 1–20 минут до облучения. Клетки фиксировали во временных точках от 10 до 120 минут после облучения 4% параформальдегидом в PBS в течение 5-10 минут с последующим применением блокирующего буфера, содержащего 10% фетальной телячьей сыворотки и 0,2% сапонина в PBS в течение 30 минут

Анализ терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы (TdT) dUTP Nick-End Labeling (TUNEL)

разрывов ДНК было обнаружено на участках, поврежденных лазером в митотических хромосомах, с помощью анализа TUNEL; Мечение dUTP открытых 3’-концов цепей ДНК.За анализом следили в соответствии с протоколом производителя (Roche Applied Science).

Анализ изображения

изображений Tiff были проанализированы и впоследствии отредактированы для увеличения контраста и интенсивности с помощью программного обеспечения Image J [43]. Перед усилением контраста измеряли среднюю интенсивность пикселей (MPI) для участков, поврежденных лазерным излучением ДНК. Фон идентифицировали как область за пределами области повреждения ДНК, и среднюю интенсивность пикселей этой области вычитали из интенсивности флуоресценции линий или пятен, содержащих повреждение ДНК, чтобы вычислить среднюю интенсивность пикселей в поврежденной области.Положительный сигнал для флуоресцентных маркеров был основан на том, что средние значения пикселей превышают уровень фона на неповрежденных хромосомах. Наборы необработанных изображений можно найти в цифровых коллекциях библиотеки Калифорнийского университета в Сан-Диего: https://doi.org/10.6075/J08W3BQK [44].

УФ-индуцированное повреждение ДНК

U2OS подвергали воздействию света 254 нм от компактной УФ-лампы UVG-11, помещая лампу непосредственно над 50-миллиметровыми чашками для клеток на 20 секунд. Мощность лампы контролировалась с помощью измерителя мощности PM100 ThorLabs, оснащенного датчиком S120UV.Средняя мощность измерялась перед каждым экспериментом и составляла 6 мВт. Перед воздействием УФ-лампы клетки переводили в забуференный физиологический раствор Хэнкса, не содержащий фенолового красного (Invitrogen). После УФ-облучения клетки либо сразу фиксировали 4% параформальдегидом, либо помещали в инкубатор при 37 ° С перед фиксацией.

Количественное определение димера пиримидина

митотического U2OS собирали путем митотического встряхивания после синхронизации с 9 мкМ ингибитором CDK1 (Calbiochem; RO-3306). Ингибирование CDK1 приводит к остановке на G2; после удаления ингибитора клетки вступили в митоз.Собранные клетки подвергали воздействию УФ-света 265 нм от УФ-лампы UVG-11 (Science Company) в течение 20 с в среде, не содержащей фенолового красного. Затем клетки разделяли на три аликвоты и лизировали через 30, 60 и 90 минут после УФ-облучения. Реагент ДНКзол (Life Technologies) добавляли к каждому образцу для лизиса и выделения ДНК в соответствии с протоколом производителя. Выделенные образцы ДНК были количественно определены с использованием Nanodrop 2000c (Thermo Scientific) и разбавлены до рабочей концентрации 2,0 мкг / мл в холодном PBS. Образцы ДНК дополнительно разводили в планшете на 96-луночных планшетах с высоким связыванием ДНК.Для определения концентрации димеров пиримидина в каждой лунке с образцом использовали набор OxiSelect для УФ-индуцированного повреждения ДНК ELISA Combo Kit (Cell Biolabs Inc). Планшеты считывали с помощью планшет-ридера Biotek Conquer ELX800 (Biotek Inc).

Статистический анализ

Prism 7 для MAC OS использовалась для всего статистического анализа. Если не указано иное, для сравнения с контролями выполняли Т-тест. Значения считались значимыми, если P <0,05. Коробчатые диаграммы показывают 95% доверительные интервалы.Необработанные числа и количественные оценки можно найти в quantifications.xls в разделе «Дополнительная информация». Изображения, используемые для количественной оценки, можно найти по следующему адресу: https://doi.org/10.6075/J08W3BQK [44].

Результаты

Лазер вызывает комплексное повреждение ДНК на митотических хромосомах

Оптимальные параметры лазера для обнаружения и последовательного образования повреждений ДНК в митотических хромосомах были получены путем (а) варьирования освещенности и сравнения изменений фазово-контрастного изображения и (б) анализа накопления Nbs1 и продукции γh3AX.Для этого исследования мы использовали освещенность 2,8–3,2×10 ¹¹ Вт / см ² , если не указано иное. Это облучение позволило нам немедленно определить, что хромосомы были эффективно повреждены из-за быстрых изменений фазового контраста в облученных областях хромосомы (стрелки на рис. 1A на 4 и 6s). Темный материал, который может отражать разделение фаз, виден через 16 секунд после лазерного воздействия. В другом примере клетки, зафиксированной через ~ 5 секунд после лазера, мы видим, что γh3AX окружает область, на которую нацелен лазер (рис. 1B).В предыдущем исследовании мы показали, что темный материал является результатом накопления белков DDR и что γh3AX может окружать белки и / или перекрываться с ними [34]. Кроме того, при этих облучениях γh3AX и Nbs1 обнаруживались почти в 100% случаев (48 из 48 клеток) и (16 из 17 клеток) соответственно.

Рис. 1. Характеристика лазерно-индуцированного повреждения ДНК.

(A) При выбранной освещенности 3,0×10 ¹¹ Вт / см ² наблюдаются изменения фазового контраста в месте лазерного повреждения на прометафазных хромосомах в синхронизированных с нокодазолом клетках U2OS (4 и 6s).Через 16 секунд после лазера (см. Стрелки) видна фаза темного материала. Шкала шкалы = 1 мкм. (B) γh3AX образуется вокруг области хромосомы, поврежденной лазером. Метафазная ячейка фиксировалась через ~ 5 с после воздействия лазера и иммуноокрашивалась на γh3AX (стрелки и вставка). Эту ячейку фиксировали до накопления темного материала. Во врезке наблюдается палинг. (C) Положительный TUNEL виден в поврежденных лазером областях (стрелки) в прометафазных клетках, инкубированных с нокодазолом. Две разные хромосомы были повреждены в разные моменты времени в одной и той же клетке.Первое повреждение было вызвано за 30 минут до фиксации, а второе повреждение было вызвано через 20 минут после первого повреждения и зафиксировано через 10 минут. Сигнал TUNEL на втором месте повреждения был ярче, чем сигнал на первом повреждении. График сигнала TUNEL справа представляет собой среднее значение шести ячеек на категорию, n = 6. Среднее значение и среднее значение стандартной ошибки для поздней резки (фиксированные через 10 минут после лазерной резки) составляют 195 ± 61 и 23 ± 8 для ранней резки. (исправлено 30 минут после лазера). p = 0,0363 Шкала шкалы = 1 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g001

Тип повреждения ДНК, индуцированного лазером на митотических клетках, оценивали с помощью иммуноокрашивания для (1) белков ответа на повреждение ДНК, (2) поврежденных оснований и (3) тест TUNEL. Если не указано иное, эксперименты проводили на человеческих клетках U2OS. Положительный TUNEL на участках лазерно-индуцированного повреждения ДНК продемонстрировал наличие разрывов END, рис. 1C (пурпурный). Сигнал TUNEL был выше в хромосомах, зафиксированных через 10 минут после лазера, по сравнению с теми, которые были зафиксированы через 30 минут после лазера.Эти результаты показывают, что у факторов могли быть сломанные концы.

В поврежденных хромосомах было обнаружено несколько белков DDR, которые предоставляют информацию о типе повреждений, созданных лазером. Последовательное производство γh3AX демонстрирует способность лазеров индуцировать DSB. Димеры пиримидина (ДПД) в результате лазерного воздействия также были обнаружены и будут обсуждаться далее в этой статье. XRCC1, который участвует в репарации однонитевых разрывов (SSB), эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) и эксцизионной репарации оснований (BER), локализованных в поврежденной лазером ДНК (S1A Fig) [45].Однако нам не удалось обнаружить существенное повреждение оснований в областях, нацеленных на лазер, в диапазоне освещенности 2,8–3,2 × 10 ¹¹ Вт / см ² с использованием антитела, специфичного для 8-оксогуанина (8-oxoG) (Trevigen) (S1B). Рис). Тем не менее, ключевой компонент BER, APE-1, был обнаружен в местах лазерного повреждения, S1C Рис.

Митотические клетки подвергаются репарационному синтезу ДНК

Поскольку обычно считается, что репарация ДНК ингибируется в митозе, мы непосредственно отслеживали событие репарации в митотических клетках путем включения аналога тимидина 5-этинил-2’-дезоксиуридина (EdU).Для этих экспериментов клетки инкубировали либо за 10 минут до воздействия лазера, либо через 10 минут после воздействия лазера. Для обоих условий клетки фиксировали через 30 минут после лазера (фиг. 2А). Клетки, поврежденные в метафазе, были способны включать аналоги, и это включение было окружено γh3AX, о котором известно, что он распространяется на соседний хроматин [46, 47]. Два примера ячеек для каждого условия показаны на рис. 2B и 2C. Значительный ремонт произошел в течение первых 10 минут после воздействия лазера, рис. 2В. Синтез репарации ДНК не ограничивается начальными 10 минутами после лазера, поскольку клетки, инкубированные с пост-лазером EdU, все еще были положительными на EdU, хотя и слабее, демонстрируя продолжающийся синтез ДНК, рис. 2C и 2D.Включение EdU (т.е. репарация) наблюдали во многих клеточных линиях во время митоза: U2OS (рис. 2B и 2C) и изогенных клеточных линиях M059K и M059J (рис. 2E, верхняя панель и нижняя панель, соответственно).

Рис. 2. Митотические клетки подвергаются репарации синтеза ДНК.

(A) Схема инкубации EdU для экспериментальных результатов, показанных на (B-E). В первом сценарии EdU добавляли к клеткам за 10 минут до воздействия лазера, чтобы обеспечить проникновение в клетки до повреждения. По второму сценарию.EdU был добавлен к клеткам через 10 минут после лазера, чтобы проверить, продолжается ли восстановление. Все клетки фиксировали через 30 минут после лазера. (B) Флуоресцентные изображения синхронизированных с нокодазолом клеток U2OS (остеосаркомы), поврежденных в условиях, изображенных на схеме выше, были окрашены на EdU и γh3AX. γh3AX частично перекрывает и окружает EdU. (B и C) Показаны две репрезентативные клетки для каждого условия. Масштабная шкала = 10 мкм (D) Количественная оценка интенсивности EdU в месте повреждения в клетках, инкубированных до или после лазера.Средняя пиксельная интенсивность EdU в клетках, предварительно инкубированных с EdU, составляла 505 ± 72 и 87 ± 25 для клеток, инкубированных после лазера, n = 8 и 7 соответственно. p = 0,0004 (E) Изогенные клетки глиобластомы M059K (верхняя панель) и M059J (нижняя панель) окрашивали на включение EdU и γh3AX.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g002

Медиаторы путей восстановления DSB

В попытке определить, какие компоненты реакции на повреждение ДНК могут быть активными после лазерного повреждения митотических хромосом, были протестированы несколько датчиков повреждения, адаптерных белков и преобразователей на их способность кластеризоваться к участкам лазерного повреждения.Наша оценка начинается с ответа DSB. DSB являются одними из самых вредных, поскольку они могут привести к хромосомным транслокациям, если их не исправить [48].

Во время интерфазы комплекс MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) является одним из первых факторов, распознающих DSB [49, 50]. При выбранной освещенности все три компонента комплекса MRN обнаруживаются в местах повреждения, вызванного лазером, в митотических клетках (рис. 3A – 3C). В соответствии с присутствием γh3AX, MDC1, который связывается с γh3AX [51], также задействован (Рис. 3D).Хотя было обнаружено, что ответы BRCA1, 53BP1 и Ubiquitin (Ub) ослабляются в митозе [52, 53], мы ранее показали Ub-сигнал на участках повреждения, вызванного лазером NIR в клетках PtK1 [28]. В настоящем исследовании накопление Ub также наблюдалось в митотических клетках U2OS (рис. 3C). Ответ Ub в сайтах повреждения является критическим для локализации BRCA1 и 53BP1 в DSB в интерфазных ядрах [54, 55]. Коррелируя с присутствием сигнала Ub в сайтах митотических повреждений, мы наблюдали накопление BRCA1 и 53BP1 в сайтах митотических повреждений (Fig. 3E-3G).Наши результаты показывают, что Ub, BRCA1 и 53BP1 могут быть задействованы в высококластеризованных сайтах индуцированных лазером повреждений на митотических хромосомах.

Рис. 3. Митотическое повреждение ДНК, индуцированное лазером, приводит к рекрутированию различных белков DDR, включая те, которые ранее не наблюдались при митотическом повреждении ДНК.

Клетки на этом рисунке были зафиксированы в течение 30 минут после лазерного повреждения. (A-C) Комплекс MRN (MRE-11, Rad50, Nbs1) образуется на хромосомах, поврежденных лазером. Показаны синхронизированные с нокодазолом клетки U2OS.ИРЭ-11, Рад50, НБС1. (C-E) Ub, KU, MDC1, 53BP1 и BRCA1 также наблюдались на хромосомах, поврежденных лазером. Шкала шкалы = 10 мкм. (E и F) Иммуноокрашивание BRCA1 с использованием двух разных антител. (E) Антитело BRCA1 ab16780 (Abcam). (F) Антитело BRCA1 OP107 (Calbiochem). (F-G) показывают локализацию BRCA1 и 53BP1 по отношению к yh3AX.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g003

Полная сборка негомологичных факторов присоединения концов в ответ на повреждение митотической ДНК

NHEJ наблюдали в митотических повреждениях ДНК с помощью лазера NIR в двух отдельных исследованиях [28, 38].В наших исследованиях KU накапливалась в течение первых 5–15 мин после лазерного излучения (рис. 4A). Напротив, привлечение ДНК-лигазы IV, которая опосредует концевое соединение на более позднем этапе NHEJ, не было очевидным до 20 минут после облучения (рис. 4A и 4B). ДНК PKcs и XRCC4, партнер по связыванию лигазы IV, также была обнаружена при лазерном повреждении (рис. 4C и 4D). Следовательно, полная сборка факторов NHEJ может происходить в митозе.

Рис. 4. Кластеры факторов NHEJ при повреждении митотической ДНК.

(A) KU локализуется в поврежденных хромосомах в клетках, зафиксированных через 5–15 минут после лазерного воздействия.Прямоугольная диаграмма показывает интенсивность сигнала иммуноокрашенных KU и LIGASE IV клеток U2OS. Клетки поддерживали в нокодазоле на протяжении экспериментов и фиксировали при: 5-15 мин, 20-25 мин и 50-55 мин. Средние значения и средняя стандартная ошибка для KU: 236 ± 31 N = 7, 149 ± 40 N = 7 и 108 ± 19 N = 9 соответственно. Средние значения и средняя стандартная ошибка Ligase для тех же временных интервалов: 3,5 ± 2,3 N = 7, 30 ± 11 N = 7, 22 ± 12 N = 9. Доверительные интервалы показаны для обоих графиков. (B) Изображения U2OS, окрашенного KU и LIGASE IV, зафиксированные через 10, 20 и 50 минут после лазера.Стрелка показывает область, на которую нацелен лазер, и увеличенную область в виде вставки. Масштабная линейка = 10 мкм. (C) Кластеры DNA-Pkcs в поврежденных хромосомах U2OS. На вставке показано увеличенное изображение иммуноокрашенных ДНК-PKcs на участке разреза. (D) Иммуно-меченные XRCC4 и γh3AX также видны в области повреждения лазером.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g004

Классический NHEJ зависит от ДНК-PKcs. Мы исследовали вклад NHEJ в восстановление синтеза ДНК с использованием ДНК-PKcs-дефицитных (M059J) и изогенных ДНК-PKcs-позитивных (MO59K) линий клеток.Иммуноокрашивание ДНК-Pkcs в изогенных линиях подтвердило его присутствие в M059K и отсутствие в M059J (S2A на фиг.). Тем не менее, синтез репарации ДНК наблюдался в обеих клеточных линиях (рис. 2E и 5B). Точно так же клетки U2OS, обработанные 3 мкМ ингибитором ДНК-PKcs NU 7441, не показали значительных различий по сравнению с контрольными клетками (фиг. 5A ДМСО против ингибитора ДНК-PKcs).

Рис. 5. Митотический синтез ДНК на ДНК поврежденных хромосомах клеток с нарушенной активностью ATM, ДНК PKcs или PARP.

(A) Синхронизированные с нокодазолом клетки U2OS, обработанные ингибиторами PARP (100 мкМ NU1025), ATM (10 мкМ Ku55933) и ДНК PKcs (3 мкМ NU7741), оценивали на синтез ДНК.Каждый эксперимент был нормализован к среднему значению соответствующего контроля ДМСО. (B) Синхронизированные клетки PtK2, обработанные ДМСО, ингибитором ATM и комбинированными ДНК-PKcs и ATM. (C) Синхронизированные с нокодазолом изогенные клеточные линии человека M059K и M0959J (с дефицитом ДНК-PKcs) обрабатывали ингибитором ATM. На графике нанесен процент положительных клеток. Над каждой полосой указано количество ячеек в каждой категории. Значения, используемые для этого графика, представлены на рис. S4. EdU был флуоресцентно помечен с помощью анализа Click-it для проверки синтеза репарации (D) CtIP и (E) RPA были обнаружены на поврежденных лазером хромосомных областях иммуноокрашенных фиксированных клеток U2OS 15 ( верхняя панель) и 30 минут (нижняя панель) после лазера.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g005

Альтернатива-NHEJ (alt-NHEJ) также может восстанавливать DSB, когда DNA-PKcs скомпрометирован [56]. Было показано, что поли (АДФ-рибоза) полимераза 1 (PARP1) играет ключевую роль в alt-NHEJ [57, 58]. Таким образом, мы ингибировали PARP в клетках U2OS с помощью 100 мкМ NU 1025 и проверили эффективное ингибирование путем иммуноокрашивания на поли (АДФ-рибоза) (S2B фиг.). На фиг. S2D изображены необработанные митотические клетки U2OS, положительные с окрашиванием PAR в месте повреждения.Интересно, что результаты EdU на клетках, синхронизированных с нокодазолом, предполагают, что ингибирование PARP может приводить к большему синтезу ДНК (рис. 5A, ДМСО против PARPi). Поскольку известно, что ингибирование PARP стимулирует c-NHEJ, влияние PARPi на включение EdU было исследовано в клетках с дефицитом ДНК-PKcs [39, 59, 60]. Ингибирование PARP не отменяет синтез ДНК в участках митотического повреждения ДНК (S2C фиг.). Эти результаты показывают, что передача сигналов PARP играет роль в подавлении репарации ДНК во время митоза.

Гомологичная рекомбинация активируется в митозе и может инициировать образование филаментов RAD51 в отсутствие функциональных ДНК-PKcs или CDK1

Гомологичная рекомбинация может сохранить целостность генома во время репарации DSB.Этот процесс основан на резекции поврежденных концов ДНК и гомологичной матрицы для синтеза новой ДНК и сохранения целостности генома. Киназа ATM является ключом к активации этого пути репарации [61, 62]. Одновременное ингибирование PKcs ATM и ДНК ослабляло синтез ДНК в участках митотического повреждения в клетках PtK2 (рис. 5B). Точно так же клетки MO59J, обработанные ингибитором ATM, почти полностью отменили EdU (фиг. 5C). Поскольку было показано, что ATM стимулирует репарацию HR в интерфазе [61, 62], эти результаты повышают вероятность того, что когда оба пути c- и alt-NHEJ ингибируются, факторы HR могут вносить вклад в репарацию ДНК во время митоза.

Ключевой первый шаг к репарации HR включает резекцию конца ДНК посредством CtIP с последующим связыванием RPA с резецированными концами ДНК [63]. В соответствии с предыдущими исследованиями, в которых использовался мейотический экстракт Xenopus для мониторинга репарации DSB, мы наблюдали CtIP и RPA в участках митотического лазерного повреждения, предполагая продолжающуюся резекцию конца (рис. 5D и 5E) [64].

За резекцией конца и связыванием RPA происходит образование филаментов RAD51 для инвазии гомологичных цепей. Ранее сообщалось, что RAD51 не накапливается в поврежденном мейотическом хроматине из X . laevis яичный экстракт, если CDK1 не был ингибирован [64]. Точно так же нам не удалось наблюдать образование филаментов RAD51 в митотических клетках U2OS, синхронизированных с нокодазолом (рис. 6A и 6C). Напротив, накопление RAD51 наблюдалось на участках лазерного повреждения в интерфазных клетках, зафиксированных через 25 минут после лазерного повреждения. Аналогичные результаты были получены с другой линией клеток человека, CFPAC-1, что указывает на то, что это не является явлением, специфичным для определенного типа клеток (S2E и S2F фиг.).

Рис. 6. Поврежденные ДНК участки хромосом лишены RAD51.

(A) Процент клеток U2OS, зафиксированных через 25–90 минут после лазера, которые являются положительными по RAD51 в соответствии с митотической фазой на основе данных иммунофлуоресцентного окрашивания. Ингибирование CDK1 заставляет некоторые клетки представлять средние значения пикселей выше фона, MPI = 53 ± 16 в шести из 9 ячеек. Соответствующая коробчатая диаграмма может быть дополнительными файлами. (B) Клетки с дефицитом ДНК Pkcs (M059J) также демонстрируют большую вероятность превышения фоновых уровней RAD51 по сравнению с U2OS. Девять из двенадцати имели положительный RAD51, MPI = 121 ± 67.Соответствующий график можно найти в дополнительных файлах. C) Митотические клетки U2OS, окрашенные на γh3AX и RAD51. (D) U2OS, обработанный 10 мкМ ингибитором CDK1, претерпел преждевременный цитокинез и деконденсацию хромосом. Тем не менее, RAD51 совмещен с γh3AX и выглядит пунктирным вдоль дорожки на увеличенном изображении области в рамке, показанной в столбце RAD51. (E) Изогенные линии глиобластомы M059K и (F) M059J были ДНК повреждены лазером и окрашены на γh3AX и RAD51. (F) Клетки M059J (дефицитные по ДНК-PKcs) показывают RAD51 в месте повреждения.Шкала шкалы = 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g006

Было показано, что CDK1 играет роль в ингибировании HR в митозе [9, 11, 64, 65]. Клетки, обработанные 10 мкМ ингибитором CDK1 R0-3306, претерпели преждевременный цитокинез и / или деконденсацию хромосом в течение 5-10 минут после добавления ингибитора (фиг. 6D). Доля CDK1, ингибирующая митотические клетки U2OS, продемонстрировала несколько более высокие значения пикселей флуоресценции над фоном (53 ± 16), чем контрольные клетки, значения которых были отрицательными (Фиг.6A и 6D).RAD51 выглядит нитевидным на участках повреждения, показывая положительное окрашивание RAD51 (фиг. 6D, стрелки на увеличенном изображении). Однако уровни интенсивности флуоресценции не находились в том же положительном диапазоне RAD51 (1305 ± 222 средняя интенсивность пикселей), который наблюдается в интерфазных клетках. Таким образом, по-видимому, другие пути, независимые от активности CDK1, могут регулировать супрессию RAD51.

Интересно, что в отсутствие ДНК-PKcs большинство клеток (9 из 12) обнаруживали некоторое количество RAD51 на участках повреждения (MPI = 121 ± 67)). Эти результаты предполагают, что митотическая ДНК-PKcs также регулирует накопление RAD51 в кластерных сайтах повреждения (рис. 6B и 6F).Интересно, что картина окрашивания RAD51 отличается от наблюдаемой в клетках U2OS, ингибированных CDK1 (сравните увеличенное изображение, то есть 10-кратное изображение на фиг.6D и 6F). Клетки M059K не обнаруживали RAD51, локализованного в области повреждения (рис. 6E).

В отличие от NHEJ, мы наблюдали накопление факторов, участвующих только в ранней части пути HR в сайтах повреждения ДНК на митотических хромосомах. И CtIP, и RPA со временем увеличиваются, что свидетельствует об образовании большего количества разрывов нитей или резекции концов. Напротив, рекрутирование и Rad51, и cohesin было заблокировано (S2 фиг.).Мы обнаружили, что связывание RAD51 ингибируется не только CDK1 [13], но также ДНК-PKcs в митозе (рис. 6). Недостаток cohesin может быть связан с тем, что он дестабилизируется во время митоза и / или способствует только HR между сестринскими хроматидами, но не др. Типам HR [66, 67].

Митотический синтез репарации ДНК не является специфическим для лазера феноменом

Наши результаты маркировки EdU убедительно показывают, что в митозе происходит восстановление индуцированных лазером повреждений. Чтобы подтвердить, что восстановление синтеза митотической ДНК может происходить в клетках, поврежденных другими способами, мы подвергли клетки воздействию ультрафиолетового света от лампы и затем изолировали с помощью FACS с использованием антитела, специфичного для фосфорилированного гистона h4 серина 10 (фосфо-h4S10) (рис. 7A, красный).Фосфо-h4S10 является наибольшим во время митоза, и поэтому митотическая популяция может быть легко отделена от интерфазной популяции. Митотические клетки наносили на график зависимости интенсивности флуоресценции EdU (фиг. 7A, нижние панели). Диаграммы разброса показывают, что 50 процентов клеток окрашиваются положительно на EdU в ответ на УФ-излучение по сравнению с 30 процентами контрольных клеток. Гистограмма тех же результатов на фиг. 7B показывает увеличение доли клеток, окрашиваемых положительно на EdU (красная гистограмма по сравнению с синей).Результаты показывают, что восстановление ультрафиолетовых повреждений может происходить в митотических клетках, а митотическое восстановление не является специфическим явлением лазерного повреждения. Среди наших результатов есть результаты, показывающие, что митотические клетки способны удалять димеры пиримидина (CPD), что подтверждено с помощью ELISA УФ-поврежденных клеток, рис. 7C. Точно так же клетки, поврежденные лазером, продемонстрировали уменьшение димеров пиримидина, рис. 7D. Клетки PtK2 и U2OS, окрашенные на CPD, показаны на фиг. 7E и 7F соответственно.

Рис. 7. УФ-индуцированная репарация повреждений ДНК в митозе.

(A) FACS клеток U2OS, окрашенных на митотический маркер, фосфо-h4S10 (ось y) в зависимости от бокового рассеяния (ось x) на двух верхних панелях. Клетки, которые окрашивались положительно на фосфо-h4S10, наносили на график против EdU (ось x) на нижних панелях. Правый квадрант каждого графика показывает митотические клетки, окрашенные положительно на EdU. Большая часть клеток является положительной на EdU после УФ-облучения. Сравните 30% без УФ с 50% с УФ. (B) Гистограмма обеих популяций клеток, поврежденных / подвергшихся УФ-облучению красным цветом и неповрежденных синим цветом, чтобы показать, как популяции смещаются в сторону более сильного сигнала EdU после воздействия УФ-излучения.(C) ELISA популяции синхронизированных митотических и интерфазных клеток, не подвергшихся воздействию лазерного УФ-излучения, собранных через 30, 60 и 90 минут после воздействия. N = 3 повторения для митотических популяций и N = 2 для интерфазных клеток. (D) Количественная оценка интенсивности CPD в митотических клетках U2OS по сравнению через 10 минут и 3 часа после лазера, N = 5 на категорию. (E) митотический PtK2, хромосома которого была повреждена лазером (стрелка). На изображении клетки после фазы фиксации видно темное пятно в месте лазерной резки. На участке воздействия видны димеры циклобутанпиримидина (красный цвет).(F) Хромосома U2OS, положительная по димерам циклобутан-пиримидина (зеленый) на поврежденном участке.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g007

Митотическое повреждение ДНК переносится в интерфазу

Была исследована способность кластерных повреждений митотической ДНК накапливать RAD51 после митоза. В наших исследованиях RAD51 не обнаруживался, если только активность CDK1 и / или ДНК-PKcs не была нарушена. Таким образом, клетки были исследованы на способность факторов HR привлекаться к лазерному повреждению, создаваемому в митозе после того, как клетки вошли в G1.Мы обнаружили, что в следующей фазе G1 RAD51 действительно накапливается в повреждениях ДНК, вызванных предыдущим митозом (рис. 8A и 8B). EdU совместно с RAD51 указывает на возможность того, что HR может быть ответственным за некоторые включения и что восстановление продолжается (рис. 8B и 8D). Клетка, поврежденная в метафазе и зафиксированная через 40 часов после митоза, все еще подвергается репарационному синтезу ДНК (рис. 8D).

Рис. 8. Митотическое повреждение ДНК, перенесенное в G1, предполагает продолжающуюся репарацию.

Клетки, поврежденные в митозе, фиксированные через 2 часа после деления и иммуноокрашенные на нижестоящие факторы HR и NHEJ, а также на EdU.(A) RAD51 и γh3AX локализуются в одной и той же области ячейки G1. (B) EdU и RAD51 совместно локализуются друг с другом и с фазовым темным пятном клетки G1. (C) XRCC4 и γh3AX немного перекрываются в ячейке G1. На вставках показаны в увеличенном масштабе участки повреждений, указанные стрелками. (D) Через сорок часов после митоза клетка имеет фазовое темное пятно, окруженное γh3AX и локализованное совместно с EdU. Шкала шкалы = 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g008

Кроме того, мы оценили, присутствуют ли по-прежнему факторы NHEJ в G1 из-за повреждений, вызванных митозом.Иммуноокрашивание на XRCC4 показало, что на самом деле XRCC4 все еще присутствует в G1 (рис. 8C). Таким образом, кажется, что клетка может пытаться восстановить кластерные лазерные повреждения, используя факторы NHEJ и HR. Ранее мы сообщали, что BRCA1 и 53BP1 также наблюдались после митоза [28]. Этот результат дальнейший ремонт опор продолжается.

Мы исследовали способность клеток, поврежденных в метафазе, анафазе и G1, завершать митоз и вступать в последующий митоз. Для этого неповрежденные клетки U2OS, собранные в условиях нашего культивирования, показали среднее время деления 37 ± 5 часов после цитокинеза.Значения рассчитывали, взяв время цитокинеза и проследив за клеткой до ее вступления в последующий митоз (контроль S3 A, N = 11 клеток). В результате за поврежденными клетками наблюдали не менее 40 часов.

Большинство митотических клеток, поврежденных лазером, попало в G1, 26 из 28 клеток повреждены в метафазе и 8 из 10 клеток повреждены в анафазе (рис. 9A и 9B). Одна клетка, поврежденная в метафазе, погибла. Дочерние клетки, которые делились, отслеживались и вступали в митоз i.е. Завершение клеточного цикла оценивали в пределах окна наблюдения до 40–47 часов после повреждения ДНК. Доля (21%) дочерних клеток с повреждениями, нанесенными в прометафазе, претерпела последующий митоз, по сравнению с 37% для дочерних клеток, несущих повреждения, вызванные в анафазе. Показаны примеры покадрового анализа клеток, поврежденных в метафазе и анафазе, в которых обе дочерние клетки претерпели последующий митоз (рис. 10А и 10С). Клетки, которые не делятся и не возвращаются, показаны на фиг. 10B и 10D.Дочерним клеткам, несущим поврежденный хроматин, требовалось больше времени для деления, чем их аналогам без поврежденного хроматина (S3B фиг.).

Рис. 9. Судьба клеток, поврежденных в митозах и G1.

(A) Двадцать восемь метафазных клеток были повреждены лазером. Красная точка обозначает лазерное повреждение. Двадцать шесть из двадцати восьми разделились. У одного произошел регресс борозды. Другой подвергся расщеплению с последующей гибелью клеток. Судьбы дочерних наборов показаны ниже. Зеленое ядро ​​отмечает S-фазу.Divides сокращенно обозначается как div. Суммируются шесть различных исходов: 1) обе дочери умирают, 2) обе дочери стареют, 3) одна дочь находится в состоянии S, а другая стареет, 4) обе дочери стареют, 5) одна дочь разделилась, а другая стареет, и 6 ) обе дочери делят. (B) Десять клеток были повреждены ДНК во время анафазы. Восемь клеток перешли в G1. Из двух, которые не перешли в G1, у одного произошла регрессия борозды, а другой, похоже, слился в более поздний момент. Суммируются пять результатов для дочерей: 1) в одной группе обе дочери были в стадии старения, 2) в трех группах одна была в S, а другая в старении, 3) в одной группе было разделение дочерей, а у другой — в фазе S, 4) в другой группе было одно дочернее деление. дочь разделилась, а другая была дряхлой и 5) в двух наборах обе дочери разделились.(C) Были идентифицированы девять сестер G1. По одной сестре из каждого набора была повреждена. Клетка, содержащая поврежденное ядро, имеет красную точку. Все неповрежденные сестры разделились. Пять поврежденных сестер разделились.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g009

Рис. 10. Промежуток времени клеток, поврежденных в митозе.

(A) Монтаж ДНК клетки, поврежденной в метафазе, дочери которой прошли митоз через 36 и 40 часов после деления. Лазерное повреждение создавалось 63-кратным объективом.Поэтому на первом изображении клетки кажутся больше. Последующие изображения были сделаны с объективом 20x, чтобы расширить поле зрения. (B) Клетка, поврежденная метафазной ДНК, борозда которой регрессировала через 1 час. (C) Монтаж клетки, поврежденной в Анафазе, дочери которой делятся в 36:30 и 40:30 часов. (D) Анафазная ячейка, которая кажется разделенной, см. 00:50 и 13:20. Однако в 13:40 и 15:00 в клетке начинается регресс борозды. Шкала шкалы = 10 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g010

Поврежденные клетки G1 также отслеживали, чтобы сравнить их способность к репарации с таковой митотических клеток. Эти клетки были идентифицированы путем отслеживания анафазных клеток до завершения деления и образования двух дочерних клеток. Из обеих дочерних клеток только одна сестра была повреждена лазером. Однако за обеими сестрами следили. Перед фиксацией все клетки инкубировали с EdU для проверки состояния S-фазы клеток, которые не делились в пределах окна наблюдения. Рис. 9 содержит сводку судеб клеток.

Как и ожидалось, все неповрежденные сестры G1 вошли в митоз в пределах окна наблюдения. Из девяти поврежденных клеток пять разделились, то есть 55% разделились. Наши результаты предполагают, что повреждение в метафазе более вредно, чем повреждение, индуцированное в анафазе или G1 (рис. 9C). Несмотря на это, эти результаты демонстрируют, что процент (25%) клеток, поврежденных лазером в митозе (в метафазе и / или анафазе), способны подвергнуться последующему митозу.

Обсуждение

Используя высоко сфокусированный NIR-лазер, мы определили, что реакция митотического повреждения ДНК более обширна, чем считалось ранее.Мы подтвердили, что в наших условиях NIR-лазер вызывает комплексное повреждение ДНК, включая разрывы цепей ДНК и повреждение сшивания УФ-излучением, рис. 11A. Кроме того, мы продемонстрировали связанные с DDR посттрансляционные модификации в сайтах повреждения, включая γh3AX, Ub и PAR, фиг. 11B. Кроме того, мы обнаружили рекрутирование факторов, участвующих в различных путях репарации ДНК, включая репарацию DSB и SSB, BER и NER, рис. 11B. Вместе с включением EdU в участки повреждения наши результаты убедительно свидетельствуют об активации этих путей репарации.Наши данные также указывают на то, что хотя NHEJ может возникать, процесс восстановления HR не завершается во время митоза. Наши результаты также предполагают митоз-специфические эффекты передачи сигналов DDR, которые диктуют выбор пути репарации, выявляя сложные механизмы ответа на митотические повреждения ДНК и репарации.

Рис. 11. Краткое содержание статьи: Ответ на митотическое повреждение ДНК.

(A) Фемтосекундный лазер с длиной волны 780 нм был сфокусирован в субмикронную область митотической хромосомы. Концевые разрывы, обнаруженные с помощью анализа TUNEL, и димеры циклобутанового пиримидина были обнаружены в месте повреждения лазером.(B) Несколько факторов сгруппированы в месте повреждения. Жирным шрифтом выделены аббревиатуры путей восстановления, с которыми наиболее тесно связан каждый фактор. Негомологичное соединение концов (NHEJ), восстановление однонитевого разрыва (SSBR), эксцизионное восстановление оснований (BER), гомологичная рекомбинация (HR), посттрансляционные модификации (PTM), эксцизионная репарация нуклеотидов (NER). Синтез ДНК происходит в поврежденной области хромосомы, что определяется с помощью включения EdU. Фосфорилированный гистон γh3AX на серине 139 отмечает двухцепочечные разрывы и выходит из пятна лазерного повреждения.Основываясь на привлечении соответствующих белков, мы предполагаем, что эти пути восстановления могут быть активированы во время митоза. Следует отметить, что хотя факторы, участвующие как в ранних, так и в поздних стадиях NHEJ, легко обнаруживаются, были обнаружены только те, которые участвуют в ранней стадии HR, что позволяет предположить, что NHEJ может быть полностью активным, в то время как HR может быть инициирован, но не завершен во время митоза.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.g011

Лазер как метод выявления DDR во время митоза

Предыдущие исследования, в которых использовалось ионизирующее излучение и радиомиметики для индукции ДР, не показали накопления убиквитина (Ub), RNF8, RNF168, BRCA1, 53BP1 в митотических хромосомах [2, 5–14].Однако это могло быть связано с ограниченной плотностью повреждения ДНК, что заставляло эти исследования полагаться на формирование индуцированного ионизирующим излучением фокуса (IRIF) этих факторов. IRIF отличается от начального набора факторов распознавания повреждений ДНК и влечет за собой дальнейшее кластеризацию белков, а также сигналы амплификации, которые окружают участки повреждения [50, 68]. Наша способность обнаруживать все факторы, вероятно, связана с более высокой плотностью повреждения ДНК в небольшом субмикронном объеме, чем в предыдущих исследованиях, что позволяет обнаруживать высокую концентрацию факторов повреждения.Действительно, Ub и KU были обнаружены на участках повреждения митотических хромосом с использованием аналогичных лазерных систем [28, 38].

Митотическая DDR может пытаться восстановить хромосомы более чем одним путем

Наши результаты показывают, что восстановление HR в митозе останавливается на этапе рекрутирования Rad51 как CDK1, так и DNA-PKcs. Это может быть связано не только с конкуренцией между NHEJ и HR. Скорее, усиление связывания и экспансии RPA указывает на то, что сломанные концы резецированы, и что хроматин может быть подготовлен для репарации HR позже в интерфазе.Накопление RAD51 происходило при ингибировании либо CDK1, либо ДНК-PKcs, что указывает на то, что для эффективного ингибирования RAD51 необходимы оба фактора.

В отличие от остановки HR, факторы, участвующие как в ранних, так и в поздних стадиях NHEJ, рекрутируются в поврежденные хромосомы. Кроме того, сигнал KU был ниже, когда сигнал ДНК-лигазы был выше, что убедительно свидетельствует о том, что путь NHEJ активирован и, вероятно, восстанавливает часть повреждений ДНК, индуцированных лазером. Хотя клетки, дефицитные по ДНК-PKcs (ключевому компоненту NHEJ), все еще синтезируют ДНК, ингибирование PARP (ключевой игрок в alt-NHEJ) увеличивает синтез репарации ДНК.Это предполагает, что alt-NHEJ не является основным путем репарации в митозе и что PARP оказывает ингибирующее действие на репарацию ДНК в митозе, возможно, за счет выбора пути репарации.

Одновременное ингибирование ATM и DNA-PKcs значительно снижает синтез репарации ДНК. Это может быть связано со способностью обеих киназ фосфорилировать γh3AX. Следовательно, комбинированное ингибирование может препятствовать привлечению нижестоящих факторов, таких как MDC1 [69]. Альтернативно, поскольку RAD51 накапливается в сайтах повреждения в отсутствие ДНК-PKcs, а ATM, как известно, опосредует HR [61], RAD51-опосредованная репарация HR (кроме HR сестринской хроматиды) может вносить вклад в синтез репарации ДНК в митозе.Более того, недавно было показано, что активность ATM важна для NER-опосредованной вторичной репарации DSB [70]. Следовательно, двойное ингибирование может препятствовать как первичной, так и вторичной репарации DSB. Хотя эти возможности не исключают друг друга, необходимы будущие исследования, чтобы определить, активен ли весь путь NER в митозе, и наш лазер, который может вызывать УФ-повреждение, будет отличным инструментом для этого. Взятые вместе, наши результаты предполагают, что синтез репарации ДНК может происходить в митозе за счет комбинации различных путей репарации, что диктуется передачей сигналов DDR и доступностью репарационных белков.

Митотический синтез репарации ДНК и репарационный синтез, индуцированный стрессом репликации

Предыдущие исследования показали, что вызванное стрессом репликации повреждение ДНК может приводить к репарационному синтезу ДНК в очень ранней профазе, но не в более поздних фазах митоза. Синхронизированные в нокодазоле клетки не подвергались репарационному синтезу ДНК [16, 17]. Однако механизм синтеза репарации ДНК, наблюдаемый в нашем исследовании, вероятно, отличается от этих исследований в том, что (1) наше повреждение наносится в более поздней профазе, метафазе и анафазе и (2) наше повреждение не связано с репарацией, индуцированной активным репликационным стрессом.Процесс, описанный в Bhowmick et al., 2016 и Minocherhomiji et al., 2015, зависит от Rad52 и MUS81-EME1. Кроме того, Pederson et al. обнаружили, что недостаточно реплицированные области были помечены TopBP1 в митозе и что ToPBP1 способствует незапланированному синтезу ДНК [71]. Следовательно, механизмы, регулирующие синтез / репарацию ДНК во время митоза, вероятно, зависят от типа повреждения, количества и фазы, в которой индуцируется повреждение. Может быть интересно определить, требует ли репарация ДНК, индуцированная в ранней профазе средствами, отличными от репликационного стресса, некоторые из тех же факторов, упомянутых выше.

Повреждение, индуцированное в метафазе, более опасно для деления клеток

В условиях нашего лазера значительный процент (25%) клеток, поврежденных в митозе, подвергается второму делению. Клетки, поврежденные в метафазе, с меньшей вероятностью войдут во второе деление по сравнению с клетками, поврежденными в анафазе или G1. Это может быть вызвано облучением более компактной метафазной хромосомы, что приводит к большему повреждению ДНК, чем в G1. Выбор пути репарации ДНК в митозе может быть другим важным фактором.Предыдущее исследование с использованием другого лазера (лазер на ионах аргона, излучающий свет с длиной волны 488 или 514 нм) показало, что клетки, поврежденные в митозе, способны претерпевать последующий митоз и производить явно нормальные клетки [26]. Это важно, потому что вступление во второй митоз свидетельствует о восстановлении контрольной точки и, следовательно, репарации ДНК до такой степени, что она больше не останавливает развитие клеточного цикла.

В заключение, наши результаты показывают, что (1) митотические клетки способны к репарационному синтезу ДНК, (2) это может быть инициировано различными механизмами репарации; и (3) нарушается, когда ингибируются как ATM, так и ДНК-PKc, и стимулируется, когда ингибируется PARP.(4) Кроме того, часть клеток, поврежденных в митозе, может подвергнуться достаточному восстановлению, чтобы перейти ко второму делению.

Дополнительная информация

S1 Рис. Оценка реакции митотического повреждения ДНК.

(A) Фактор репарации SSB XRCC1 обнаруживается в лазерном участке, который совмещен с NBS1. Слегка увеличенная вставка объединенных изображений между XRCC1 и NBS1 показана в правом нижнем углу. (B) Окислительное повреждение основания в форме 8-оксогуанидина не было заметно выше в областях хромосомы, поврежденных лазером.Справа — график интенсивности пикселей окислительного повреждения на участке лазерного повреждения и за пределами участка повреждения. N = 24 (C) APE-1 был обнаружен при повреждении митотической ДНК через 5, 10 и 15 минут после лазерного излучения. Клетка, зафиксированная на 15-й минуте, имеет две точки повреждения лазером. (D) Привлечение XPA к лазерному повреждению, созданному на двух разных хромосомах в одной и той же клетке.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.s001

(TIFF)

S2 Рис. Ответ на повреждение ДНК в различных клеточных линиях (M059K, M059J и CFPAC1).

(A) Количественная оценка ДНК-PKcs в M059J и M059K демонстрирует, что интенсивность положительна в M059K, но не в клетках M059J (N = 3). (B) PARylation происходит в поврежденных областях хромосомы. Обработка 100 М ингибитором PARP NU1025, обозначенным как PARPi, приводит к снижению PAR-илирования. Митотический (N = 5), митотический PARPi (N = 3), интерфазный (N = 4), межфазный PARPi (N = 4). (C) Клетки MO59J, обработанные PARPi, все положительны в отношении EdU. (D) Монтаж изображает репрезентативную ячейку с γh3AX зеленым и PAR красным, DAPI синим.(E) Изображения накопления RAD51 в клетках CFPAC-1 во время интерфазы и его отсутствия в митотических клетках, поврежденных в митозе (нижняя панель) Масштабная полоса = 10 мкм. (F) Уровни митотических клеток RAD51 были ниже или на том же уровне, что и фон для клеток CFPAC-1. (G) В клетке U2OS RPA обнаруживается на митотической клетке, но не на RAD21.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.s002

(TIFF)

S1 Данные. Необработанные значения и количественные оценки (quantifications.xls), которые соответствуют рисункам 1C, 2C, 4A, 5A – 5C, 6A, 6B, 7C, 7D, S2A, S2B, S2C и S2F.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0227849.s005

(XLSX)

Благодарности

Особая благодарность Артуру Фореру, доктору философии. (Йоркский университет, Торонто, Онтарио) и Пханг-Ланг Чен, доктор философии. (Калифорнийский университет в Ирвине, Ирвин, Калифорния) за побуждающие к размышлениям разговоры о митотических реакциях на повреждение ДНК.

Список литературы

1. 1. Кастедо М., Перфеттини Дж. Л., Румье Т., Валент А., Раслова Х., Якушидзин К. и др. Митотическая катастрофа представляет собой особый случай апоптоза, подавление которого влечет за собой анеуплоидию.Онкоген. 2004. 23 (25): 4362–70. pmid: 15048075.
2. 2. Ортвейн А., Фраде-Тюркотт А., Нурдермеер С.М., Кэнни М.Д., Брун С.М., Стрекер Дж. И др. Митоз подавляет репарацию двухцепочечных разрывов ДНК для защиты от слияния теломер. Наука. 2014; 344 (6180): 189–93. pmid: 24652939.
3. 3. Краста К., Ганем Н.Дж., Дагер Р., Лантерманн А.Б., Иванова Е.В., Пан Й. и др. Разрывы ДНК и измельчение хромосом из-за ошибок митоза. Природа. 2012. 482 (7383): 53–8. pmid: 22258507; PubMed Central PMCID: PMC3271137.
4. 4. Бахум С.Ф., Кабеч Л., Комптон Д.А., Пауэлл С.Н., Бастианс Х. Реакция на повреждение митотической ДНК: на перекрестке структурных и численных нестабильностей хромосом рака. Тенденции рака. 2017; 3 (3): 225–34. pmid: 28718433; PubMed Central PMCID: PMC5518619.
5. 5. Джунта С, Белоцерковская Р, Джексон СП. Передача сигналов о повреждении ДНК в ответ на двухцепочечные разрывы во время митоза. J Cell Biol. 2010. 190 (2): 197–207. Epub 2010/07/28. jcb.2006 [pii] pmid: 20660628.
6. 6. Huang X, Tran T, Zhang L, Hatcher R, Zhang P. Митотическая катастрофа, вызванная повреждением ДНК, опосредуется Chk1-зависимой контрольной точкой повреждения ДНК выхода из митоза. Труды Национальной академии наук Соединенных Штатов Америки. 2005. 102 (4): 1065–70. Epub 2005/01/15. pmid: 15650047; PubMed Central PMCID: PMC545827.
7. 7. Ли Д.Х., Ачарья С.С., Квон М., Дрейн П., Гуан Й., Адельмант Дж. И др. Дефосфорилирование позволяет задействовать 53BP1 в двухцепочечных разрывах ДНК.Mol Cell. 2014. 54 (3): 512–25. pmid: 24703952; PubMed Central PMCID: PMC4030556.
8. 8. Nelson G, Buhmann M, von Zglinicki T. Очаги повреждения ДНК в митозе лишены 53BP1. Клеточный цикл. 2009. 8 (20): 3379–83. Epub 2009/10/07. pmid: 19806024.
9. 9. Вэй Чжан ГП, Шиау-Инь Линь и Пумин Чжан. Ответ на повреждение ДНК подавляется высокой активностью Cdk1 в митотических клетках млекопитающих. Журнал биологической химии. 2011; 107 (15): 6870–5. Epub, 29 марта 2010 г.
10. 10.Чжан В., Пэн Г., Линь С.Ю., Чжан П. Ответ на повреждение ДНК подавляется высокой циклин-зависимой активностью киназы 1 в митотических клетках млекопитающих. Журнал биологической химии. 2011. 286 (41): 35899–905. pmid: 21878640
11. 11. ван Вугт М.А., Гардино А.К., Линдинг Р., Остхаймер Г.Дж., Рейнхардт Х.С., Онг С.Е. и др. Сеть обратной связи митотического фосфорилирования соединяет Cdk1, Plk1, 53BP1 и Chk2 для инактивации контрольной точки повреждения ДНК G (2) / M. PLoS Biol. 2010; 8 (1): e1000287. pmid: 20126263; PubMed Central PMCID: PMC2811157.
12. 12. Бенада Дж., Бурдова К., Лидак Т., фон Морген П., Макурек Л. Поло-подобная киназа 1 ингибирует ответ на повреждение ДНК во время митоза. Клеточный цикл. 2015; 14 (2): 219–31. pmid: 25607646; PubMed Central PMCID: PMC4613155.
13. 13. Peterson SE, Li Y, Chait BT, Gottesman ME, Baer R, Gautier J. Cdk1 разъединяет CtIP-зависимую резекцию и образование филаментов Rad51 во время репарации двухцепочечных разрывов в М-фазе. Журнал клеточной биологии. 2011. 194 (5): 705–20. pmid: 21893598
14. 14.Терасава М., Шинохара А., Шинохара М. Каноническое негомологичное соединение концов в митозе вызывает нестабильность генома и подавляется специфическим для М-фазы фосфорилированием XRCC4. PLoS Genet. 2014; 10 (8): e1004563. pmid: 25166505; PubMed Central PMCID: PMC4148217.
15. 15. Фэн В., Джасин М. Защита вилок гомологической рекомбинации и репликации: BRCA2 и многое другое! Колд Спринг Харб Symp Quant Biol. 2017; 82: 329–38. pmid: 29686033; PubMed Central PMCID: PMC6333483.
16. 16.Bhowmick R, Minocherhomji S, Hickson ID. RAD52 способствует синтезу митотической ДНК после стресса репликации. Mol Cell. 2016; 64 (6): 1117–26. pmid: 27984745.
17. 17. Minocherhomji S, Ying S, Bjerregaard VA, Bursomanno S, Aleliunaite A, Wu W. и др. Стресс репликации активирует синтез репарации ДНК в митозе. Природа. 2015; 528 (7581): 286–90. pmid: 26633632.
18. 18. Ying S, Minocherhomji S, Chan KL, Palmai-Pallag T, Chu WK, Wass T и др. MUS81 способствует экспрессии общего хрупкого сайта.Nat Cell Biol. 2013; 15 (8): 1001–7. pmid: 23811685.
19. 19. Ханада К., Будзовска М., Дэвис С.Л., ван Друнен Э., Онидзава Х., Беверло ХБ и др. Структурно-специфическая эндонуклеаза Mus81 способствует перезапуску репликации за счет создания двухцепочечных разрывов ДНК. Nat Struct Mol Biol. 2007. 14 (11): 1096–104. pmid: 17934473.
20. 20. Davies SL, North PS, Hickson ID. Роль BLM в перезапуске репликационной вилки и подавлении срабатывания ориджина после репликативного стресса. Nat Struct Mol Biol.2007. 14 (7): 677–9. pmid: 17603497.
21. 21. Мин Дж, Райт У., Шей Дж. У. Альтернативное удлинение теломер, опосредованное митотическим синтезом ДНК, задействует процессы репликации, индуцированные разрывом. Mol Cell Biol. 2017; 37 (20). pmid: 28760773; PubMed Central PMCID: PMC5615184.
22. 22. Feng W., Jasin M. BRCA2 подавляет вызванные стрессом репликации митотические и G1 аномалии посредством гомологичной рекомбинации. Nat Commun. 2017; 8 (1): 525. pmid: 28
    5; PubMed Central PMCID: PMC5597640.
23. 23. Berns MW. Направленная потеря хромосом с помощью лазерного микрооблучения. Наука. 1974. 186 (4165): 700–5. Epub 1974/11/22. pmid: 4607753.
24. 24. Berns MW. Лазерное микрооблучение хромосом. Колд Спринг Харб Symp Quant Biol. 1974; 38: 165–74. Epub 1974/01/01. pmid: 4133983.
25. 25. Berns MW. Лазерный микропучок как зонд для определения структуры и функции хроматина. Методы Cell Biol. 1978; 18: 277–94. Epub 1978/01/01. pmid: 683019.
26. 26.Бернс М.В., Ченг В.К., Гувер Г. Деление клеток после лазерного микрооблучения митотических хромосом. Природа. 1971. 233 (5315): 122–3. Epub 1971/09/10. pmid: 12058751.
27. 27. Бернс М.В., Олсон Р.С., Раунды DE. Производство хромосомных поражений in vitro с помощью микропучка аргонового лазера. Природа. 1969; 221 (5175): 74–5. Epub 1969/01/04. pmid: 4882051.
28. 28. Gomez-Godinez V, Wu T, Sherman AJ, Lee CS, Liaw LH, Zhongsheng Y и др. Анализ реакции двухцепочечного разрыва ДНК и структуры хроматина в митозе с использованием лазерного микрооблучения.Nucleic Acids Res. 38 (22): e202. Epub 2010/10/07. gkq836 [pii] pmid: 20923785; PubMed Central PMCID: PMC3001094.
29. 29. Сильва Б.А., Стамбо-младший, Йокомори К., Шах СП, Бернс М.В. Повреждение ДНК на одном конце хромосомы задерживает наступление анафазы. J Biol Chem. 2014. 289 (33): 22771–84. pmid: 24982423; PubMed Central PMCID: PMC4132783.
30. 30. Бернс М.В., Чонг Л.К., Хаммер-Уилсон М., Миллер К., Сименс А. Генетическая микрохирургия с помощью лазера: создание клональной популяции клеток кенгуру крысы (PTK2) с направленным дефицитом в хромосомном ядрышке-организаторе.Хромосома. 1979; 73 (1): 1–8. Epub 1979/06/21. pmid: 487905.
31. 31. Kong X, Mohanty SK, Stephens J, Heale JT, Gomez-Godinez V, Shi LZ, et al. Сравнительный анализ различных лазерных систем для изучения клеточного ответа на повреждение ДНК в клетках млекопитающих. Nucleic Acids Res. 2009; 37 (9): e68. pmid: 19357094; PubMed Central PMCID: PMC2685111.
32. 32. Сакилабон Круз GM, Конг X, Силва Б.А., Хатибзаде Н., Тай Р., Бернс М.В. и др. Фемтосекундное лазерное микрооблучение в ближнем инфракрасном диапазоне показывает критическую роль передачи сигналов PARP на сборках факторов в местах повреждения ДНК.Nucleic Acids Res. 2016; 44 (3): e27. pmid: 26424850; PubMed Central PMCID: PMC4756852.
33. 33. Гомес-Годинез В., Вакида Н.М., Дворников А.С., Йокомори К., Бернс М.В. Рекрутирование белков пути распознавания повреждений и репарации ДНК после облучения клеток фемтосекундным лазером в ближнем ИК-диапазоне. J Biomed Opt. 2007; 12 (2): 020505. Epub 2007/05/05. pmid: 17477704.
34. 34. Gomez-Godinez V, Wu T, Sherman AJ, Lee CS, Liaw LH, Zhongsheng Y и др. Анализ реакции двухцепочечного разрыва ДНК и структуры хроматина в митозе с использованием лазерного микрооблучения.Nucleic Acids Res. 2010; 38 (22): e202. pmid: 20923785; PubMed Central PMCID: PMC3001094.
35. 35. Kong X, Ball AR Jr., Pham HX, Zeng W, Chen HY, Schmiesing JA и др. Отличительные функции человеческого cohesin-SA1 и cohesin-SA2 в репарации двухцепочечных разрывов. Mol Cell Biol. 2014; 34 (4): 685–98. pmid: 24324008; PubMed Central PMCID: PMC3

    4.

36. 36. Конг X, Стивенс Дж., Болл А. Р. младший, Хил Дж. Т., Ньюкирк Д. А., Бернс М. В. и др. Рекрутирование конденсина I в повреждения ДНК, обогащенные базовыми повреждениями, модулируется PARP1.PLoS One. 2011; 6 (8): e23548. pmid: 21858164; PubMed Central PMCID: PMC3155556.
37. 37. Сильва Б.А., Стамбо-младший, Бернс М.В. Нацеливание на теломер-содержащие хромосомы заканчивается фемтосекундным лазером ближнего инфракрасного диапазона для изучения активации реакции на повреждение ДНК и путей восстановления повреждений ДНК. J Biomed Opt. 2013; 18 (9): 095003. pmid: 24064949; PubMed Central PMCID: PMC3782557.
38. 38. Мари П.О., Флореа Б.И., Персенгиев С.П., Веркаик Н.С., Брюггенвирт Х.Т., Модести М. и др.Для динамической сборки комплексов сращивания концов необходимо взаимодействие Ku70 / 80 и XRCC4. Proc Natl Acad Sci U S. A. 2006; 103 (49): 18597–602. Epub 2006/11/25. 06003 [pii] pmid: 17124166.
39. 39. Сакилабон Круз GM, Конг X, Силва Б.А., Хатибзаде Н., Тай Р., Бернс М.В. и др. Фемтосекундное лазерное микрооблучение в ближнем инфракрасном диапазоне показывает критическую роль передачи сигналов PARP на сборках факторов в местах повреждения ДНК. Nucleic Acids Res. 2015. pmid: 26424850.
40. 40. Вакида Н.М., Ли К.С., Ботвиник Е.Т., Ши Л.З., Дворников А., Бернс М.В.Лазерная нанохирургия одиночных микротрубочек обнаруживает зависящие от местоположения скорости деполимеризации. Журнал биомедицинской оптики. 2007; 12 (2): 024022. Epub 2007/05/05. pmid: 17477737.
41. 41. Гомес-Годинез В., Вакида Н.М., Дворников А.С., Йокомори К., Бернс М.В. Рекрутирование белков пути распознавания повреждений и репарации ДНК после облучения клеток фемтосекундным лазером в ближнем ИК-диапазоне. Журнал биомедицинской оптики. 2007; 12 (2): 020505. Epub 2007/05/05. pmid: 17477704.
42. 42. Ботвиник Е.Л., Венугопалан В., Шах СП, Лиав Л.Х., Бернс М.В.Контролируемая абляция микротрубочек с помощью пикосекундного лазера. Biophys J. 2004; 87 (6): 4203–12. Epub 2004/09/30. [pii]. pmid: 15454403; PubMed Central PMCID: PMC1304929.
43. 43. Расбанд WS. ImageJ Bethesda, Мэриленд, США: США. Национальные институты здоровья; 1997–2009 гг. Доступно по адресу: http://rsb.info.nih.gov/ij/.
44. 44. Гомес Годинез В.К. Сами; Шерман Адрия; У Тао; Коэн Ширли; Конг Сяндуо; Ёкомори Кёко; и другие. Данные из: повреждение ДНК, индуцированное во время митоза, подвергается репарационному синтезу ДНК.Цифровые коллекции библиотеки Калифорнийского университета в Сан-Диего. 2020. https://doi.org/10.6075/J08W3BQK.
45. 45. Лондон RE. Структурная основа репарации ДНК, опосредованной XRCC1. Ремонт ДНК (Amst). 2015; 30: 90–103. pmid: 25795425; PubMed Central PMCID: PMC5580684.
46. 46. Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Иванова VS, Боннер WM. Двухцепочечные разрывы ДНК индуцируют фосфорилирование гистона h3AX по серину 139. J Biol Chem. 1998. 273 (10): 5858–68. Epub 1998/04/16. pmid: 9488723.
47. 47.Rogakou EP, Boon C, Redon C, Bonner WM. Мегабазные домены хроматина, участвующие в двухцепочечных разрывах ДНК in vivo. J Cell Biol. 1999. 146 (5): 905–16. Epub 1999/09/09. pmid: 10477747; PubMed Central PMCID: PMC2169482.
48. 48. Яровая О.В., Рубцов М., Юдинкова Е., Цфасман Т., Разин С.В., Вассецкий Ю.С. Динамика двухцепочечных разрывов и хромосомных транслокаций. Молочный рак. 2014; 13: 249. pmid: 25404525; PubMed Central PMCID: PMC4289179.
49. 49. Узиэль Т., Леренталь Ю., Мойал Л., Андегеко Ю., Миттельман Л., Шайло Ю.Необходимость комплекса MRN для активации АТМ повреждением ДНК. EMBO J. 2003; 22 (20): 5612–21. Epub 2003/10/09. pmid: 14532133; PubMed Central PMCID: PMC213795.
50. 50. Ким Дж. С., Красиева Т. Б., Курумизака Х., Чен Д. Д., Тейлор А. М., Йокомори К. Независимое и последовательное рекрутирование факторов NHEJ и HR в участки повреждения ДНК в клетках млекопитающих. J Cell Biol. 2005. 170 (3): 341–7. Epub 2005/08/03. jcb.200411083 [pii] pmid: 16061690; PubMed Central PMCID: PMC2171485.
51. 51. Штуки М., Клаппертон Дж. А., Мохаммад Д., Яффе МБ, Смердон С. Дж., Джексон С. П..MDC1 напрямую связывает фосфорилированный гистон h3AX, чтобы регулировать клеточные ответы на двухцепочечные разрывы ДНК. Клетка. 2005. 123 (7): 1213–26. Epub 2005/12/27. pmid: 16377563.
52. 52. Лукас С., Меландер Ф., Штуки М., Фальк Дж., Беккер-Йенсен С., Голдберг М. и др. Mdc1 сочетает распознавание двухцепочечного разрыва ДНК с помощью Nbs1 с его h3AX-зависимым удержанием хроматина. Эмбо Дж. 2004; 23 (13): 2674–83. pmid: 15201865.
53. 53. Джунта С, Белоцерковская Р, Джексон СП. Передача сигналов о повреждении ДНК в ответ на двухцепочечные разрывы во время митоза.J Cell Biol. 190 (2): 197–207. Epub 2010/07/28. jcb.2006 [pii] pmid: 20660628.
54. 54. Стюарт Г.С. Решение ЗАГАДКИ о привлечении 53БП1 к участкам повреждения. Клеточный цикл. 2009. 8 (10): 1532–8. Epub 2009/04/18. 8351 [pii]. pmid: 19372751.
55. 55. Стюарт Г.С., Паньер С., Таунсенд К., Аль-Хаким А.К., Колас Н.К., Миллер Е.С. и др. Белок синдрома RIDDLE опосредует убиквитин-зависимый сигнальный каскад в местах повреждения ДНК. Клетка. 2009. 136 (3): 420–34. Epub 2009/02/11.S0092-8674 (09) 00005-1 [pii] pmid: 19203578.
56. 56. Perrault R, Wang H, Wang M, Rosidi B, Iliakis G. Резервные пути NHEJ подавляются DNA-PK. Журнал клеточной биохимии. 2004. 92 (4): 781–94. Epub 2004/06/24. pmid: 15211575.
57. 57. Mansour WY, Rhein T, Dahm-Daphi J. Альтернативный путь соединения концов для репарации двухцепочечных разрывов ДНК требует PARP1, но не зависит от микрогомологий. Nucleic Acids Res. 2010. 38 (18): 6065–77. pmid: 20483915; PubMed Central PMCID: PMC2952854.
58. 58. Ван М., Ву В., Ву В., Росиди Б., Чжан Л., Ван Х и др. PARP-1 и Ku конкурируют за репарацию двухцепочечных разрывов ДНК разными путями NHEJ. Nucleic Acids Res. 2006. 34 (21): 6170–82. pmid: 17088286; PubMed Central PMCID: PMC1693894.
59. 59. Saberi A, Hochegger H, Szuts D, Lan L, Yasui A, Sale J.E., et al. RAD18 и поли (ADP-рибоза) полимераза независимо подавляют доступ негомологичных концевых соединений к двухцепочечным разрывам и способствуют репарации, опосредованной гомологичной рекомбинацией.Mol Cell Biol. 2007. 27 (7): 2562–71. pmid: 17242200; PubMed Central PMCID: PMC1899888.
60. 60. Домингес-Бендала Дж., Масутани М., МакВир Дж. Снижение регуляции PARP-1, но не Ku80 или DNA-PKcs, приводит к более высокой эффективности нацеливания на гены. Cell Biol Int. 2006. 30 (4): 389–93. pmid: 16504547.
61. 61. Бакр А., Оинг С., Кохер С., Боргманн К., Дорнрайтер И., Петерсен С. и др. Участие ATM в гомологичной рекомбинации после резекции конца и образования нуклеофиламента RAD51.Nucleic Acids Res. 2015; 43 (6): 3154–66. Epub 2015/03/11. pmid: 25753674; PubMed Central PMCID: PMC4381069.
62. 62. Бойхер А., Бирро Дж., Чоуандонг Л., Бартон О., Шибата А., Конрад С. и др. ATM и Artemis способствуют гомологичной рекомбинации индуцированных облучением двухцепочечных разрывов ДНК в G2. EMBO J. 2009; 28 (21): 3413–27. pmid: 19779458; PubMed Central PMCID: PMC2752027.
63. 63. Мойнахан М.Э., Джасин М. Митотическая гомологичная рекомбинация поддерживает геномную стабильность и подавляет онкогенез.Обзор природы Молекулярная клеточная биология. 2010. 11 (3): 196–207. Epub 2010/02/24. pmid: 20177395; PubMed Central PMCID: PMC3261768.
64. 64. Peterson SE, Li Y, Chait BT, Gottesman ME, Baer R, Gautier J. Cdk1 разъединяет CtIP-зависимую резекцию и образование филаментов Rad51 во время репарации двухцепочечных разрывов в М-фазе. J Cell Biol. 194 (5): 705–20. Epub 2011/09/07. jcb.201103103 [pii] pmid: 21893598; PubMed Central PMCID: PMC3171114.
65. 65. Василев LT. Селективный низкомолекулярный ингибитор раскрывает важные митотические функции человеческого CDK1.Труды Национальной академии наук. 2006. 103 (28): 10660–5. pmid: 16818887
66. 66. Potts PR, Porteus MH, Yu H. Комплекс SMC5 / 6 человека способствует гомологичной рекомбинации сестринских хроматид путем рекрутирования комплекса когезина SMC1 / 3 на двухцепочечные разрывы. EMBO J. 2006; 25 (14): 3377–88. pmid: 16810316; PubMed Central PMCID: PMC1523187.
67. 67. Нишияма Т., Сикора М.М., Хьюис ин ‘т Вельд П.Дж., Мехтлер К., Петерс Дж.М. Aurora B и Cdk1 опосредуют активацию Wapl и высвобождение ацетилированного когезина из хромосом путем фосфорилирования сорорина.Proc Natl Acad Sci U S. A. 2013; 110 (33): 13404–9. pmid: 23
68. 1; PubMed Central PMCID: PMC3746921.
69. 68. Селеста А., Фернандес-Капетилло О., Крулак М.Дж., Пилч Д.Р., Штаудт Д.В., Ли А. и др. Фосфорилирование гистона h3AX необходимо для начального распознавания разрывов ДНК. Nat Cell Biol. 2003. 5 (7): 675–9. Epub 2003/06/07. [pii]. pmid: 12792649.
70. 69. Жесткий Т., О’Дрисколл М., Риф Н., Ивабучи К., Лобрич М., Джегго П.А. ATM и DNA-PK функционируют дублирующе, фосфорилируя h3AX после воздействия ионизирующего излучения.Cancer Res. 2004. 64 (7): 2390–6. pmid: 15059890.
71. 70. Вакасуги М., Сасаки Т., Мацумото М., Нагаока М., Иноуэ К., Инобе М. и др. Образование двухцепочечных разрывов ДНК, зависимое от эксцизионной репарации, и активация передачи сигналов ATM в покоящихся клетках млекопитающих. J Biol Chem. 2014. 289 (41): 28730–7. pmid: 25164823; PubMed Central PMCID: PMC4192521.
72. 71. Pedersen RT, Kruse T, Nilsson J, Oestergaard VH, Lisby M. TopBP1 необходим при митозе для уменьшения передачи повреждений ДНК дочерним клеткам G1.J Cell Biol. 2015; 210 (4): 565–82. pmid: 26283799; PubMed Central PMCID: PMC4539992.

Пластика паховой грыжи — Как это проводится

Пластика паховой грыжи может быть выполнена как открытая операция, так и лапароскопическая операция (или операция «замочная скважина»).

Больница пришлет вам инструкции о том, когда вам нужно прекратить есть и пить перед операцией.

Операция обычно занимает от 30 до 45 минут, и вы обычно сможете вернуться домой в тот же день.

Некоторые люди остаются в больнице на ночь, если у них есть другие проблемы со здоровьем или они живут самостоятельно.

Подробнее о восстановлении после пластики паховой грыжи.

Открытая хирургия

Открытая пластика паховой грыжи часто проводится под местной анестезией или регионарной анестезией, введенной в позвоночник.

Это означает, что вы будете бодрствовать во время процедуры, но оперируемая область будет немеющей, поэтому вы не почувствуете боли.

В некоторых случаях используется общий наркоз. Это означает, что вы будете спать во время процедуры и не почувствуете боли.

Как только анестетик подействует, хирург делает над грыжей один разрез (надрез). Этот разрез обычно составляет от 6 до 8 см в длину.

Затем хирург помещает кусок жировой ткани или петлю кишечника обратно в брюшную полость (живот).

Сетку накладывают на брюшную стенку, в слабое место, где грыжа вышла, чтобы укрепить ее.

Когда ремонт будет завершен, ваша кожа будет зашита швами. Обычно они рассасываются сами по себе в течение нескольких дней после операции.

Если грыжа была ущемлена и часть кишечника повреждена, возможно, потребуется удалить пораженный сегмент и соединить два конца здорового кишечника.

Это более крупная операция, и вам, возможно, придется оставаться в больнице на 4–5 дней.

Лапароскопическая хирургия (замочная скважина)

Для пластики паховой грыжи используется общий наркоз, поэтому во время операции вы будете спать.

Во время операции по замочной скважине хирург обычно делает 3 небольших разреза в брюшной полости вместо одного более крупного разреза.

Тонкая трубка, содержащая источник света и камеру (лапароскоп), вводится через один из этих разрезов, чтобы хирург мог видеть вашу брюшную полость.

Специальные хирургические инструменты вводятся через другие разрезы, чтобы хирург мог вернуть грыжу на место.

Есть 2 типа хирургии замочной скважины.

Трансабдоминальное предбрюшинное (ТАПП)

Инструменты вводятся через мышечную стенку брюшной полости и через слизистую оболочку органов (брюшину).

Затем лоскут брюшины отслаивается над грыжей, и кусок сетки прикрепляется скобами или приклеивается к ослабленному участку брюшной стенки, чтобы укрепить его.

Абсолютно экстраперитонеально (TEP)

Это новейшая техника «замочной скважины», которая включает в себя восстановление грыжи без проникновения в брюшную полость.

По окончании ремонта надрезы на коже зашивают швами или хирургическим клеем.

Какая техника лучше?

Национальный институт здравоохранения и передового опыта (NICE), который оценивает лечение для NHS, говорит, что и замочная скважина, и открытая хирургия грыж безопасны и работают хорошо.

Прочтите руководство NICE по использованию хирургии замочной скважины для лечения паховой грыжи.

При хирургии замочной скважины после операции обычно меньше боли, потому что разрезы меньше. Мышцы меньше повреждаются, а небольшие порезы можно закрыть клеем.

Хирургия замочной скважины, как правило, быстрее восстанавливается у людей, которые:

• уже лечились, грыжа вернулась (рецидивирующая грыжа)
• имеют грыжи с обеих сторон одновременно (двусторонние грыжи)

Но риск серьезных осложнений, таких как случайное повреждение кишечника хирургом, выше при хирургии замочной скважины, чем при открытой операции.

Риск возврата грыжи одинаков после обеих операций.

Прежде чем выбрать наиболее подходящее лечение, обсудите со своим хирургом преимущества и недостатки замочной скважины и открытой хирургии.

Выбор техники для использования

Выбор методики пластики паховой грыжи во многом зависит от:

• ваше общее состояние здоровья — пожилые люди или люди с плохим здоровьем могут быть слишком слабыми или слабыми для безопасного проведения общего наркоза, поэтому может быть рекомендована открытая операция с использованием местного анестетика
• опыт вашего хирурга — открытая операция более распространена, чем операция с замочной скважиной, и не все хирурги обладают достаточным опытом в технике замочной скважины

Недавнее руководство Британского общества герниологов рекомендует лечить большинство первичных односторонних грыж (впервые появляющихся только на одной стороне) с использованием открытой техники.

Методы «замочной скважины» обычно рекомендуются только при рецидивирующих или двусторонних грыжах.

Операция «замочная скважина» также может быть полезна, если ваш хирург точно не знает, какой у вас тип грыжи.

Время ожидания в NHS

Если ваш терапевт направит вас к консультанту для специализированного лечения, например хирургического вмешательства, вы имеете право начать лечение в течение 18 недель.

Вы можете записаться на прием в больницу через электронную справочную службу NHS, пока вы еще находитесь в приемной терапевта.

Узнайте больше о времени ожидания лечения в NHS.

Последняя проверка страницы: 14 июня 2018 г.
Срок следующей проверки: 14 июня 2021 г.

Советы по ремонту автомобилей | Офис генерального прокурора

Выбор автомастерской

Вам нужна ваша машина, и когда вы оставляете ее в мастерской на ремонт, вы не можете не беспокоиться о стоимости и качестве работ, выполняемых под капотом.

Ваша лучшая защита от мошенничества и неисправных ремонтных работ — это найти известного механика или ремонтную мастерскую до того, как ваш автомобиль потребуется отремонтировать.

Сделайте домашнее задание, чтобы проверить репутацию ремонтной мастерской в ​​Интернете, а также с друзьями и семьей. Когда вы исследуете ремонтные мастерские, вы также можете узнать, есть ли у них какие-либо механики, сертифицированные ASE (Automotive Service Excellence).

Перед тем, как вы отправитесь в ремонтную мастерскую и загорится контрольная лампа двигателя, подумайте о том, чтобы отнести ее в магазин автозапчастей, который может бесплатно провести компьютерную диагностику вашего автомобиля. Затем вы можете сравнить это с тем, что вам говорят в ремонтной мастерской.

Согласно закону незаконно:

1. сознательно сделать ложное или вводящее в заблуждение заявление о необходимости запасных частей, замены или ремонта;
2. заявляют, что работа была сделана или детали были заменены, если это не так;
3. означает, что товары оригинальные или новые, тогда как на самом деле они бывшие в употреблении или отремонтированные; и
4. рекламируют товары или услуги с намерением не продавать их так, как рекламируется.

Согласно Закону о гарантии Магнуссона-Мосса, вам обычно не нужно использовать дилерский центр для регулярного обслуживания или замену деталей производителя для сохранения гарантии вашего производителя.Для получения дополнительной информации о ваших гарантийных правах в соответствии с федеральным законодательством посетите https://www.consumer.ftc.gov/articles/0138-auto-warranties-routine-main maintenance.

Разрешения на осмотр и ремонт

Вы должны получить письменное разрешение на буксировку, осмотр, тест-драйв, диагностику или разборку любой части вашего автомобиля с целью предоставления оценки затрат на ремонт до принятия мер. Это разрешение должно описывать действия, которые необходимо предпринять, обвинения и то, будут ли удалены какие-либо части или разобрано транспортное средство.Для получения дополнительной информации посетите сайт DMV Техаса по Smart Repairs.

Вас могут попросить подписать разрешение на осмотр и разрешение на начало ремонтных работ одновременно. Разрешения могут быть на одном листе бумаги, но они должны требовать отдельной подписи. Перед подписанием внимательно прочтите каждый из них.

Разрешение на начало ремонта должно также включать дату и время, когда вы подписали форму. Если вы решите произвести ремонт, убедитесь, что в исходном заказе на работу четко указаны работы, которые необходимо сделать, сборы, дата завершения, условия оплаты и многое другое.Для получения дополнительной информации посетите сайт DMV Техаса по Smart Repairs.

Чего нельзя делать

Вы не должны позволять осматривать, разбирать или поднимать ваш автомобиль на стойку до тех пор, пока вы не получите копию форм разрешения на осмотр с вашей подписью, в которой указана информация, изложенная выше.

Вы не должны предполагать, что дружеское устное соглашение позволит починить вашу машину без аргументов, судебных исков или изъятия. Получите все в письменной форме.

Вы не должны позволять никому говорить за вас при переговорах о ремонте вашего автомобиля. Обманчивые магазины будут использовать это как предлог для добавления дополнительных расходов на том основании, что ремонт был санкционирован каким-то другим лицом.

Вы не должны раскрывать номер своей кредитной карты, номер водительских прав или любую другую личную информацию, если вы четко не указали, что предоставление информации предназначено только для целей утверждения ссуды или если вы не одобрили работу, работа завершена, и готовы за это платить.

Вы должны четко указать в письменной форме, что предоставление этой информации не является разрешением на осмотр или ремонт вашего автомобиля. Разрешение на осмотр или ремонт — это совершенно отдельное разрешение, которое также требует вашей подписи. Обманчивые магазины извлекут у вас эту личную информацию, начнут работу без вашего разрешения, а затем заявят, что вы разрешили работу, потому что предоставили эту информацию, и не сделали бы этого, если бы вы не разрешили ремонт.

Не оставляйте ценные вещи в машине.

Общие проблемы ремонта автомобилей

Остерегайтесь этих потенциальных проблем:

1. Магазин ждет, пока транспортное средство не поднимется на подъемник и не будет частично разобрано, прежде чем получить ваше разрешение на ремонт. К тому времени вы, по сути, вынуждены: (а) разрешить ремонт по завышенной цене или рискуете вернуть свой автомобиль в разобранном и непригодном для использования состоянии; или (б) заплатить крупную и неожиданную плату за повторную сборку вашего транспортного средства только для того, чтобы обнаружить, что он больше не работает;
2. Магазин показывает вам грязное масло с металлическими опилками как доказательство того, что вам нужна новая трансмиссия.Практически все бывшие в употреблении трансмиссии имеют грязное масло с некоторым количеством грязи и металлических опилок. Это нормально и не обязательно означает, что вам нужна совершенно новая трансмиссия. Однако после разборки и повторной сборки трансмиссии с теми же старыми уплотнениями и деталями она обычно не работает так, как раньше;
3. Мастерская начинает ремонт вашего автомобиля, не получив предварительно вашего разрешения на выполнение ремонтных работ, а затем взимает с вас плату за ремонтные работы, которые вы не санкционировали;
4. Магазин дает вам устную оценку стоимости ремонта, а затем выставляет более высокую цену;
5. Магазин представляет, что ремонтные услуги будут завершены к определенному дню, чтобы стимулировать продажу, а затем не может завершить ремонтные работы к этому дню;
6. Магазин не раскрывает расходы на повторную сборку или осмотр до начала ремонтных работ;
7. Магазин рекламирует «Бесплатная буксировка», а затем требует, чтобы вы оплатили расходы по буксировке;
8. Магазин сообщает, что бесплатно предоставит автомобиль в аренду на время ремонта, а затем требует, чтобы вы оплатили аренду;
9. Магазин сообщает, что будет предоставлять услуги по ремонту в соответствии с гарантией, а затем взимает с вас плату за ремонтные работы, на которые распространяется гарантия;
10. Магазин начинает ремонтные работы до получения письменного разрешения на получение кредита от финансовой компании в тех случаях, когда вы занимаете деньги для оплаты ремонта.Если кредитная компания не одобряет ссуду, а работа уже сделана, вы все равно можете нести ответственность за выплату, если вы не можете показать обман;
11. Магазин не уведомляет вас и не обеспечивает вашего дополнительного письменного разрешения на выполнение любых дополнительных работ, которые не были указаны в первоначальном письменном соглашении;
12. Магазин взимает плату за компьютерную диагностику, не сообщая вам заранее, что это необходимо.

Разрешение разногласий по законопроекту

Если сумма оплаты намного превышает смету, или если работа была выполнена без вашего разрешения, и вы чувствуете, что с вас переплачена сумма, подвергайте сомнению счет.Попросите магазин записать причины разницы в стоимости и сохраните это письменное объяснение вместе со сметой работ, окончательным счетом и другими документами. Убедитесь, что механик вернет ваши старые детали. (Механик может вернуть некоторые детали, такие как генераторы и тормозные колодки, поставщику запчастей для возмещения, поэтому вы не сможете получить их все.)

Даже если вас не устраивает объяснение механиком разницы между оценкой и окончательной суммой, имейте в виду, что если вы отказываетесь оплачивать счет за ремонт — даже оспариваемый счет — механик имеет законное право оставить свою машину, пока не заплатишь.Затем вы можете подать жалобу в Генеральную прокуратуру или в Better Business Bureau и / или подать иск в суд мелких тяжб против механика.

Если вы подозреваете, что ремонтная мастерская не отремонтировала автомобиль должным образом или выставила вам слишком большую сумму, и вы не можете заставить их решить проблему, чтобы вы остались довольны, первым делом вам следует отправить автомобиль в другую ремонтную мастерскую. Дайте второму механику копию детализированной квитанции и закажите проверку предполагаемого ремонта и запчастей.Получите этот отчет в письменной форме. Если вы заметите, что та же проблема с вашим автомобилем повторяется, или обнаружите новую проблему, которой не должно было возникнуть, вы будете в лучшем положении, чтобы договориться о возмещении от первого механика, если вы получите мнение второго механика о работе, выполненной в письмо.

Если вы заплатили кредитной картой и недовольны ремонтом, выполненным механиком, вы можете оспорить списание средств с компанией, выпустившей кредитную карту. Чтобы оспорить списание средств, вы должны сделать это в письменной форме в компанию, обслуживающую вашу кредитную карту, и это должно быть сделано в течение 60 дней после получения счета по кредитной карте.Убедитесь, что вы отправили письмо о споре и всю соответствующую информацию (квитанции и документацию, подтверждающую вашу позицию) на адрес для запроса выставления счета, а не на платежный адрес. У Федеральной торговой комиссии («FTC») есть образец письма о споре, которое вы можете использовать. Компания, выпускающая кредитную карту, расследует поднятые вами вопросы и выяснит, на какой стороне спора находится механик. Компания, выпускающая кредитную карту, сообщит вам, согласны они с вами или нет. Для получения дополнительной информации по этому вопросу вы можете перейти на веб-сайт FTC.

Исправить ошибки Центра обновления Windows

Что делает это пошаговое руководство?

В этом пошаговом руководстве представлены шаги по устранению проблем с обновлениями Windows для Windows 8.1 и 7, таких как длительное сканирование или коды ошибок при установке обновлений.

Для получения справки по проблемам с Центром обновления Windows в Windows 10 см. Устранение неполадок при обновлении Windows 10.

Распространенная причина ошибок — нехватка места на диске.Если вам нужна помощь в освобождении дискового пространства, см. Советы по освобождению дискового пространства на вашем компьютере.

Общие коды ошибок

Действия, описанные в этом пошаговом руководстве, должны помочь со всеми ошибками Центра обновления Windows и другими проблемами — , вам не нужно искать конкретную ошибку для ее решения . В качестве примера приведем несколько часто встречающихся кодов ошибок: 0x0xc1

3223; 0x80240034; 0x8007000E, 0x80242006, 0x80244018, 0x80D02002, 0x80246017, 0x80240438, 0x80070070, 0x8007000D, 0x80246008, 0x80096004, 0x80070020.
Приведенные здесь шаги должны помочь исправить любые ошибки, возникающие в процессе обновления Windows.

Как это работает?

Мы начнем с того, что зададим вам вопросы об используемой вами версии Windows и проблеме, с которой вы столкнулись. Затем мы проведем вас через ряд шагов по устранению неполадок, которые подходят для вашей ситуации. В конце каждого шага вас спросят: «Решило ли это проблему?» Если проблема решена, выберите «Да», и все готово! Если проблема не решена, выберите «Нет» и продолжите пошаговое руководство.